過表達(dá)microRNA-29a上調(diào)鋅脂蛋白91對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響

目的建立高感染效率、穩(wěn)定過表達(dá)microRNA-29a(mi R-29a)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12),探索miR-29a對PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法將miR-29a前體表達(dá)載體、空白對照載體進(jìn)行慢病毒包裝,用病毒上清感染PC12并進(jìn)行抗性篩選。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-q PCR)檢測miR-29a的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-29a穩(wěn)定過表達(dá)組、空質(zhì)粒對照組以及未感染組PC12細(xì)胞的凋亡情況,利用Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-29a的關(guān)鍵靶點,RT-qPCR以及Western blot檢測預(yù)測的miR-29a下游靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果經(jīng)抗性篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞系,熒光顯微鏡下觀察各組PC12細(xì)胞的感染效率均達(dá)80%以上,miR-29a過表達(dá)組凋亡率為(5.1±0.92)%,空質(zhì)粒對照組為(1.832±0.26)%,未感染組為(1.667±0.185)%,miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡(P0.01),空質(zhì)粒對照組與未感染組細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;RT-qPCR檢測miR-29a過表達(dá)時鋅指蛋白91(ZFP91)的表達(dá)量升高,miR-29a過表達(dá)組ZFP91 mRNA的表達(dá)量是空質(zhì)粒對照組的1.835倍(P=0.000),空質(zhì)粒對照組與未感染組ZFP91 mRNA的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot檢測的ZFP91蛋白表達(dá)量與空質(zhì)粒對照組比較也升高。結(jié)論在PC12中miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,過表達(dá)miR-29a也促進(jìn)ZFP91表達(dá),其機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

利多卡 因?qū)?N 一 甲基 一 D 一 天冬氨 酸抑制大 鼠 腎上腺 嗜鉻 細(xì)胞瘤細(xì) 胞增殖 的影 響

細(xì)胞 增殖 是機(jī) 體的 基 本 生 物學(xué) 特 征 , 近來 研 究表 明 成 年 人 和 動 物 腦 內(nèi) 也 存 在 神 經(jīng) 元 再 生 的 現(xiàn) 象 L ” 〕 , 并 有 研 究 證 實 N 一 甲 基 一 D 一 天 冬 氨 酸 ( N M D A ) 受 體依賴 興 奮 性 途 徑 可 間 接 影 響 中樞 神 經(jīng) 細(xì) 胞 增 殖 t ’ ) 。 但 是臨 床劑量 的利 多卡 因 對 中樞 神經(jīng) 細(xì)胞 增的影響 尚無 定 論 , 本 研 究 擬采 用 腎上 腺 嗜 鉻細(xì) 胞 瘤 ( cP lZ ) 細(xì) 胞 作 為 中 樞 神 經(jīng) 細(xì) 胞 的 模 型 閉 , 研 究 N M D A 和 利多卡 因 對神經(jīng) 細(xì)胞增 殖 的影 響 。細(xì) 胞增殖 周期分 為 D N A 合 成前期 ( G 、 期 ) 、 D N A 合成期 (S 期 ) 、 D N A 合 成后 期 ( 儀 期 ) 和 有絲 分裂期 ( M 期 ) 。 應(yīng)用 流式細(xì)胞 術(shù)進(jìn) 行 D N A 分析 時 , 通過測 定 S P F 和 ( S 十 C Z ) / M 可 以 反映 細(xì)胞增殖 的情況 。 影 響神 經(jīng) 細(xì) 胞增 殖 的 因 素很 多 , N M D A 受 體 介 導(dǎo) 的興 奮性 氨基酸 傳遞途 徑對 中樞神經(jīng) 細(xì)胞增殖 有 間接 抑制 作 用 , eB m ab e u 等 川 發(fā)現(xiàn) N M D A 受 體 的激 活可 阻 止 成 年 哺 乳 動 物 海 馬 齒 狀 回 細(xì) 胞 增 殖 , 而 N M D A 受體 拮抗 劑 M K 一 801 可 使 正 常動 物 齒狀 回 增 殖 的細(xì)胞增 加 30 % 一 90 % , N M D A 受體 是 腦 內(nèi)興 奮 性氨 基酸 的特異 性受 體 , 在 中樞神 經(jīng) 系 統(tǒng)各 種 生理 功 能 的調(diào) 節(jié)上起 著重 要的作 用 , 如 突觸 的 可 塑性 、 學(xué) 習(xí) 記憶 、 疼 痛傳 遞 以 及 發(fā) 育過 程 中神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò) 的形 成 等 ;N M D A 受體 在 許 多腦 損 傷疾 病 的病 理 生理 發(fā) 展 過程 中也起 著關(guān)鍵作 用 , 如急慢性 神經(jīng) 障礙 、 缺 血缺 氧性 腦病等 。 在 急性 損傷 過程 ( 如休 克和 腦外 傷 ) 或 慢性 的神 經(jīng)元 性 障 礙 時 , N M D A 受 體 的 過度 激 活會 使神經(jīng)元 產(chǎn)生 進(jìn) 行性 的損傷 和 死亡 。 與此一 致 的 是 研究表 明 N M D A 受 體 拮 抗 劑 在 神 經(jīng) 元 損 傷 的 體 內(nèi) 外模 型 中都 表現(xiàn) 出神 經(jīng) 保護(hù) 作 用 , 并且 能 阻 止體 外 循環(huán) 后認(rèn)知 功能 的障 礙 , 提 示 抑 制 興 奮性 氨 基 酸受 體 活 性可 激 發(fā) 正常動物 腦 內(nèi)神 經(jīng) 干細(xì) 胞的增 殖〔 ’ 一 , 了。 在本研究 中 同樣 發(fā) 現(xiàn) 細(xì) 胞 經(jīng) 含 有 N M D A 的 培 養(yǎng) 基 培養(yǎng)后 進(jìn)入 D N A 合成期 的分 裂細(xì)胞 減少 , 細(xì) 胞增殖受到抑 制 , 證 實 N M D A 受 體依 賴 的興 奮性 途 徑 對 中 樞神 經(jīng)細(xì)胞 增殖 確有 抑制 作用 。 利 多卡 因作 為 局麻藥 和 抗 心律 失常藥 已 廣 一 泛應(yīng) 用 于 臨 床 。 但 其對 中樞 神經(jīng) 系統(tǒng) 的保護(hù) 作用 大多還 處 于 實驗 研究 階段 , 有研 究 發(fā) 現(xiàn) 利 多 卡 因可 減 少 興 奮性氨 基酸 的釋放 起 到腦保 護(hù) 的作用 1 8 1 。 本研 究 結(jié) 合臨床 利 多 卡 因應(yīng) 用 的 劑 量 范 圍 , 使 用 10 、 10 2 、 10 , 及 l擴(kuò) 胖m ol · I 洶 一 ’ 四 種 不 同 濃 度 利 多卡 因 與含 N M D A 的培 養(yǎng) 基培育 P C 12 細(xì) 胞 , 采 用流 式細(xì) 胞術(shù)解 析細(xì) 胞 周 期的 方法觀 察 了 利 多 卡 因 對 N M D A 抑 制 P 1C 2 細(xì) 胞增殖 的影 響 , 發(fā) 現(xiàn) 四 種 濃度 利 多 卡 因都 可 以 不 同 程度 的拮抗 N M D A 對 P 1C 2 細(xì)胞 增殖 的抑制 作用 , 改 善受抑 制細(xì) 胞 的增 殖 水平 , 但 10 及 1了 拜m ol · l 一 ’ 濃 度 的 利多 卡 因作 用受 抑制 細(xì)胞 后增 殖情況 仍低 于 正 常水平 , 這 可 能 因 為濃 度 偏 低影 響其 拮抗 N M D A 對 細(xì)胞增 殖 的 抑制 作 用 的效 能 , 而 10 ` 拼mo l · L 一 ’ 的較 高濃度接 近 或達(dá) 到利 多 卡因 中毒 劑量 對細(xì)胞 增殖 產(chǎn) 生 直接 抑制作 用 。 而 本研 究 中利 多卡 因 拮 抗 N M D A 對細(xì)胞增 殖 的抑 制 作用 , 并 非 是影 響 了 興 奮性 氨 基 酸的 產(chǎn) 生 和 釋放 , 而 是通 過抑 制 N M D A 受 體 通路 拮 抗對神 經(jīng) 細(xì)胞增 殖 的 抑制 作 用 , 至 于 利 多 卡 因 作 用 位點 在 N M D A 受 體通 路 中 的 位置 , 尚有 待 進(jìn) 一 步 的 研 究證實 。 綜上 所 述 , 利 多 卡 因 除 可 以 通 過 可 減少 興 奮性 氨基 酸的 產(chǎn)生 和 釋 放 減 輕 對 細(xì)胞 增 殖 的 抑 制 , 還 能 通過 抑制 N M D A 受 體通 路 拮 抗 對 神 經(jīng) 細(xì) 胞 增 殖 的抑 制作 用 。

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