奧爾帕瓦約病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 

                        Allpaahuayo virus(ALLV)

產品及特點： 

熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的奧爾帕瓦約病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒。

奧爾帕瓦約病毒染料法熒光定量PCR試劑盒產品優(yōu)勢：

1.隨時可用。

2.優(yōu)化的緩沖液可增強特異性并減少引物二聚體的形成。

3.高靈敏度，特異性和可靠性。

4.為不同的qPCR儀器提供了被動參考染料。

它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)奧爾帕瓦約病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

奧爾帕瓦約病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存： 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 ：DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

奧爾帕瓦約病毒染料法熒光定量PCR試劑盒使用方法 

一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備 

8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL上步制備的PCR 陽性對照的第4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL 相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout 或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送15次一管式病毒DNAout。

三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個

樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時，最大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm，最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、熒光定量PCR技術的基礎理論 ：

1、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析 、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析。

左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是 每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是 總的熒光強度與熒光本底的差值RT RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 總的熒光強度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 線上所有樣品的RT RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。 線上所有樣品的RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。