服務(wù)流程：

1、根據(jù)客戶提供的基因序列設(shè)計特異性引物和熒光探針（染料法只需設(shè)計引物）

2、抽提DNA、RNA，并對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄

3、實時熒光定量PCR

4、提供完整的實驗結(jié)果報告(檢測數(shù)據(jù)、溶解曲線、擴增曲線)

5、返還樣品（引物、RNA和cDNA）

樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA質(zhì)量檢測：

鏈霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒進口試劑1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

濃度測定

A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 l，剩余RNA總量為：

35 l × 0.84 gl = 29.4 g

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

使用方法：

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

以下是公司正在促銷打折產(chǎn)品：

pCMV-SPORT6 MAP3K5Phosphate Buffered Saline Dulbecco’s，10X 2 ug

1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖 英文名：   1,2,3,4,6-pentagalloylglucose 英文別名：   1,2,3,4,6-penta-O-galloy-β-D-glucose CAS登錄號：   14937-32-7 分子式：   C41H32O26 分子量：   940.68 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色粉末 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   毛茛科植物白芍 Paeonia lactiflora Pall. 的去皮干燥根 溶解性：   可溶于甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ，不溶于石油醚、氯仿等溶劑。 ：   、 、 。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

小檗胺 英文名：   Berbamine 英文別名：   (4aS,16aR)-3,4,4a,5,16a,17,18,19-Octahydro-21,22,26-trimethoxy-4,17-dimethyl-16H-1,24:6,9-dietheno-11,15-metheno-2H-pyrido[2',3':17,18][1,11]dioxacycloicosino[2,3,4-ij]isoquinoline-12-ol CAS登錄號：   478-61-5 分子式：   C37H40N2O6 分子量：   608.72 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色結(jié)晶 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   小檗科植物日本小檗 Berberis thunbergii DC. 溶解性：   微溶于水;溶于乙醇、*、氯仿和石油醚。 熔點：   197～210℃ 旋光度：   +114.6°(氯仿) ：   降壓、抗氧化、、利膽作用。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

甜茶苷 中文別名：   甜茶素、甜茶甙 英文名：   Rubusoside 英文別名：   );(4alpha)-13-(beta-D-Glucopyranosyloxy)kaur-16-en-18-oic acid beta-D-glucopyranosyl ester CAS登錄號：   64849-39-4 分子式：   C32H50O13 分子量：   642.73 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色柱狀結(jié)晶 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   薔薇科懸鉤子屬的落葉灌木甜茶( Rubus suavissimus S. Lee ) 溶解性：   易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑。 熔點：   176-179℃ 旋光度：   -33°（95%乙醇） ：   、、 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年 

七葉皂苷B 中文別名：   七葉皂甙(IB) 英文名：   Escin IB 英文別名：   Aescin IB；22α-(Acetyloxy)-16α,24,28-trihydroxy-21β-[[(Z)-2-methyl-1-oxo-2-butenyl]oxy]oleana-12-ene-3β-yl 4-O-[2-O-(β-D-gluco-hexopyranosyl)-β-D-gluco-hexopyranosyl]-β-D-gluco-hexopyranosiduronic acid CAS登錄號：   26339-90-2 分子式：   C55H86O24 分子量：   1131.26 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   白色粉末 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。 提取來源：   七葉樹科七葉樹屬植物七葉樹（Aesculus chinensis Bge）的果實 溶解性：   在水和甲醇中易溶，在乙醇和丁醇中溶解，在氯仿和乙酸中不溶。 ：   、抗?jié)B出、提高張力、。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

七葉皂苷A 中文別名：   七葉皂苷A（IA) 英文名：