定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

磷酸肌醇3激酶(PI3K)ELISA試劑盒PANK4 (D6J4R) Rabbit mAb1 Kit

磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)ELISA試劑盒Endosomal Marker Antibody Sampler Kit100 ul

磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(pACCase)ELISA試劑盒Reptin/RuvBL2 (D8N3J) Rabbit mAb100 ul

磷脂酶A2(PL-A2)ELISA試劑盒MEK1 (D2R1O) Rabbit mAb100 ul

磷酸化核因子κB抑制蛋白α(pIKBα)ELISA試劑盒SirT2 (D4S6J) Rabbit mAb100 ul

磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)ELISA試劑盒RAD21 (D5Y8S) Rabbit mAb1 Kit

磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA試劑盒Initiator Caspases Antibody Sampler Kit100 ul

磷脂酰肌醇抗體IgG/IgM(PI Ab-IgG/IgM)ELISA試劑盒Phospho-EphA2 (Tyr588) (D7X2L) Rabbit mAb300 ul
金氏金氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒DISC1 N端抗體15.625-1000pg/mlcTnI|TNNC1|CMD1FF|CMD2A|CMH7|RCM1|cTn-I|TNNI3

絲裂原依賴性癌基因蛋白抗體0.156-10ng/mlCTXI(Cross Linked C-telopeptide of Type I Collagen)|C-telopeptide of Collagen alpha-1(I) chain

兔抗DLX4抗體0.156-10ng/mlCTXII|CTX-II(Cross Linked C-telopeptide of Type II Collagen)

抑癌基因抗體0.156-10ng/mlCTX-III

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1抗體15.625-1000pg/mlEGF(Epidermal growth factor)|URG|HOMG4|Beta-Urogastrone

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3α抗體1.25-80pg/mlET-1|EDN1|ET1|HDLCQ7|PPET1|Preproendothelin-1|endothelin 1|endothelin-1|preproendothelin-1

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3β抗體0.313-20ng/mlFOXP3(Forkhead box protein P3)|DIETER|IPEX|JM2|PIDX|SCURFIN|XPID|AIID|forkhead box P3|FOXP3delta7|immune dysregulation|polyendocrinopathy|enteropathy|X-linked|Scurfin|XPIDpolyendocrinopathy|enteropathy|X-linked

多能發(fā)育相關(guān)基因2抗體62.5-4000pg/mlIFABP|FABP2|FABPI|I-FABP|I-FABP|Intestinal FABP|FABPI|fatty acid binding protein 2|intestinal|Fatty acid-binding protein 2|fatty acid-binding protein|intestinal|I-FABP|Intestinal-type fatty acid-binding protein

TNF-α膜受體抗體/DR3 死亡受體3抗體15.625-1000pg/mlIFN-γ|IFNG|IFG|IFI|Type II Interferon

死亡受體4抗體1.563-100ng/mlImmunoglobulin E

精神分裂癥易感基因抗體62.5-4000pg/mlIGF-2|IGF2|IGF-II

蓬亂蛋白1抗體1.563-100ng/mlImmunoglobulin G

兔抗人鳥苷三磷酸酶－發(fā)動(dòng)蛋白2抗體1.563-100ng/mlIgG1(Immunoglobulin G1)

轉(zhuǎn)錄因子E2F-1抗體0.781-50ng/mlIgG2α

轉(zhuǎn)錄因子E2F-2抗體62.5-4000pg/mlIL-10|IL10|IL10A|CSIF|TGIF

Cynarin自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白2檢測試劑盒20mg

p, p’-DDE(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 p, p’-DDE XLD瓊脂培養(yǎng)基 規(guī)格： 250g 用途： 用于臨床標(biāo)本及食品中志賀氏、沙門氏菌選擇性分離。（GB4789.4-2008，F(xiàn)DA BAM chapter5，ISO 657...

neochlorogenic acid外消旋阿巴卡韋標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人ATP-結(jié)合盒亞家族B成員5 (ABCB5)ELISA試劑盒 0.2ml

Casp9(Human Caspase9) ELISA Kit  人胱天蛋白酶9CAS號(hào)：119302919 維生素B2檢測試盒100THuman/人Elisa試盒301020

1caffeoylquinic acid總蛋白C檢測試劑盒20mg

CPC一水合物(=西吡銨一水合物)(>98.0%(HPLC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(HPLC)(T) CPC Monohydrate (=Cetylpyridinium Chloride Monohydrate) SH-SY5Y(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)D283 Med(人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞)

cryptochlorogenic acid阿巴卡韋相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人果糖-二醛縮酶C(ALDOC)ELISA試劑盒 0.2ml

人I型膠原(Collagen Type I)CPXM2  羧肽酶X(M14家族2)抗體規(guī)格:96T/48TSucrose規(guī)格:200mg25羥基維生素D檢測試盒20mg大鼠細(xì)胞，NRK52E細(xì)胞1x10^6cells

≥98%25g5g無機(jī)檢測試劑盒(黃嘌呤化酶比色法)gamma glutamyl transpeptidase 5

 小鼠肝細(xì)胞英文名稱：H22

Egg Yolk Agar Base250核外切酶1檢測試盒5mg蛋白激酶C檢測試盒ProteinkinaseA

97%100g1g血清鈣檢測試劑盒(鄰酚酞絡(luò)合銅比色法)apoprotein F

二氫銨(SP) 質(zhì)量規(guī)格：SP Ammonium phosphate monobasic

Dried Meat Particle100核外切酶1檢測試盒5mg蛋白激酶A檢測試盒induciblenitricoxidesynthase

97%5g5g血清鈣檢測試劑盒(鄰酚酞絡(luò)合銅比色法)ubiquitination

 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基/PDP瓊脂/King Medium A綠膿菌色素測定250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Buffered Listeria Enrichment Broth250耳石蛋白1檢測試盒5mg誘導(dǎo)型NO合酶檢測試盒Tolllikereceptor4