定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人膜攻擊復(fù)合物(MAC)ELISA試劑盒 Stat5 (D3N2B) Rabbit mAb100 ul

人褪黑素(MT)ELISA試劑盒TCF4/TCF7L2 (C9B9) Rabbit mAb500 ul

人黑素瘤衍生亮氨酸拉鏈額外核因子(MLZE)ELISA試劑盒SimpleChIP? Human c-Fos Upstream Primers100 ul

人黑色素瘤轉(zhuǎn)移表面黏附分子(MMSAM)ELISA試劑盒Phospho-PLCγ1 (Tyr783) (D6M9S) Rabbit mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)300 ul

人黑色素瘤標(biāo)記物(MART/Melan-A)ELISA試劑盒Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibody100 ul

人黑色素細(xì)胞刺激素(MSH)ELISA試劑盒Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibody20 ul

人黑色素細(xì)胞抗體(MC Ab)ELISA試劑盒Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibody10 ug

人麻疹病毒IgM(MV IgM)ELISA試劑盒Human Insulin-like Growth Factor II (hIGF-II)100 ul
饒氏無綠藻探針法熒光定量PCR試劑盒4-甲基咪唑78-5000pg/mlChi3l|Chitinase-3-like protein 3

吖啶1.563-100ng/mlACCPA|anti-cyclic citrullinated peptide antibody

3,4,5-三甲氧苯乙基胺，鹽酸鹽（1毫克/毫升的甲醇）62.5-4000pg/mlMMP-10|SL-2|STMY2|Stromelysin-2|Transin-2

6-epi強(qiáng)力霉素，65%（包含未知鹽）78.125-5000pg/mlMMP-13|MMP-13

（S）- 2 -（2,4-dioxo-tetrahydropyrimidin-1-yl）- 3-methylbutyric酸0.156-10ng/mlTie1|(Tyrosine-protein kinase receptor Tie-1)|receptor tyrosine kinase|soluble TIE1 variant 1|soluble TIE1 variant 2|soluble TIE1 variant 5|TIEsoluble TIE1 variant 4|tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homologydomains 1|tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1

trimethylphenylammonium-d9碘0.156-10ng/mlTek|Tie-2|TEK|CD202B|TIE2|VMCM|VMCM1|Angiopoietin-1 receptor|ANG-R-Tie2|Angiopoietin Receptor Tie2

氨芐青霉素亞砜78.125-5000pg/mlPLAUR|uPAR|Plasminogen Activator|Urokinase Receptor

2-O- [ 4 - [ [（2-羧乙基）氨基]羰基]苯基]巴柳氮鈉0.313-20ng/mlFst|Follistatin

3,5-吡啶二羧酸7.813-500pg/mlGsk3α|glycogen synthase kinase 3 alpha|glycogen synthase kinase-3 alpha|GSK-3 alpha

甲基芐2,3-o-isopropylidene -α- d-manno-hept-5-enofuranosid125-8000pg/mlHif1α|HIF-1α|HIF1A|ARNT-interacting protein|Basic-helix-loop-helix-PAS protein MOP1|BHLHE78|Class E basic helix-loop-helix protein 78|HIF-1-alpha|HIF1-alpha|hypoxia-inducible factor 1-alpha|Member of PAS protein 1|member of PAS superfamily 1|PAS domain-containing protein 8

4（methyl-d3-nitrosamino）- 1 -（3-吡啶基）- 1-butanone0.156-10ng/mlACV-AB|Activin AB

RAC N-雙達(dá)泊西汀15.6-1000pg/mlCA9|(Carbonic anhydrase 9)|CAIX|CA-IX|MN|Carbonic Dehydratase

（2e）- 1,4-雙（4-溴苯基）- 2-butene-1,4-dione0.156-10ng/mlErbb2|Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2

metopimazine46.875-3000pg/mlAng(Angiogenin)|ALS9|HEL168|RNASE4|RNASE5

5-methoxy-3-methylindole-2-carboxylic酸15.625-1000pg/mlADH|VP|AVP

Chrysin血栓素A2合成酶檢測(cè)試劑盒20mg

薯蕷次皂苷A 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Prosapogenin A

纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 Jumping Translocation Breakpoint / JTB 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.01639.0500

人凝溶膠蛋白（Gelsolin）ELISA試盒KCNAB1/Kv beta 1  電壓門控鉀通道蛋白1抗體規(guī)格:96T/48TBis(2ethylhexyl)maleate規(guī)格:1gγ干擾素誘導(dǎo)蛋白16檢測(cè)試盒10mg人子宮膜腺癌細(xì)胞，HEC1B細(xì)胞1x10^6cells

Reserpine血栓素B2檢測(cè)試劑盒20mg

 含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5(FNDC5)重組蛋白英文名稱：Recombinant Fibronectin Type III Domain Containing Protein 5 (FNDC5)

內(nèi)皮素1(EDN1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 LILRB2 / ILT4 / LIR-2 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.01638.0500

游離前列腺特異性抗原(FREE PSA)Annexin II/Annexin A2  膜粘連蛋白 Ⅱ抗體規(guī)格:96T/48TBisdesmethoxycurcumin規(guī)格:1gγ谷氨酰半胱氨合成酶檢測(cè)試盒20mg人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，Ishikawa細(xì)胞1x10^6cells

TF1亞酰20mg

2-(羥甲基)-15-冠5-(>96.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>96.0%(GC) 2-(Hydroxymethyl)-15-crown 5-Ether 人腺腺細(xì)胞英文名稱：

進(jìn)口、分裝酪氨羥化酶檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒5049616

97%5g25g性酶Echinococcus granulosus IgG

維生素B2 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥99%;20mg 促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH 抗體 MAP1LC3A ELISA Kit 微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3A(MAP1LC3A)ELISA試劑盒

進(jìn)口、原裝基質(zhì)裂解素2檢測(cè)試盒1gHuman/人Elisa試盒505083045

97%25g25g抑肽酶（牛肺）Neopterin antibody

甜橙黃 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Sinensetin SW 1990(人胰腺細(xì)胞)香菇 Lentinula edodes

UBA Medium啤酒中厭氧菌檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 1檢測(cè)試盒20mg游離膽固醇檢測(cè)試盒freehaemoglobin