定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)ELISA試劑盒 Phospho-PEA-15 (Ser104) Antibody100 ul

人結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白(Hpt/HP)ELISA試劑盒SH2D1A Antibody100 ul

人鳥苷酸結(jié)合蛋白4(Gbp4)ELISA試劑盒SOCS2 Antibody20 ul

人鳥苷酸解離抑制因子(GDI)ELISA試劑盒 SOCS2 Antibody100 ul

人鳥苷酸交換因子(GEF)ELISA試劑盒 Asymmetric Dimethyl-SMARCC1/BAF155 (Arg1064) (D4F2L) Rabbit mAb (ChIP Specific)100 ul

人GTP酶活化蛋白(GAP)ELISA試劑盒 PEA-15 Antibody100 ul

人生長調(diào)節(jié)致癌基因γ/黑素瘤生激因子(GROγ/CXCL3/MGSA)ELISA試劑盒 Phospho-FADD (Ser194) Antibody (Human Specific)500 ul

人生長調(diào)節(jié)致癌基因β/黑素瘤生激因子(GROβ/CXCL2/MGSA)ELISA試劑盒 CD28 (CD28.2) Mouse mAb (PE Conjugate)100 ul
羌蟲病立克次氏體探針法熒光定量PCR試劑盒枸櫞酸托瑞米芬（標(biāo)準(zhǔn)品）78.125-5000pg/mlCK-MB|CKMB(Creatine Kinase MB Isoenzyme)

異環(huán)磷酰胺62.5-4000pg/mlCKMT1A|Acidic-type mitochondrial creatine kinase(Mia-CK)|Ubiquitous mitochondrial creatine kinase(U-MtCK)|CKMT

異環(huán)磷酰胺（標(biāo)準(zhǔn)品）31.25-2000pg/mlCLCF1|BSF-3|BSF3|CISS2|CLC|NNT-1|NNT1|NR6|B-cell stimulating factor 3|CRLF1 associated cytokine-like factor 1|neurotrophin-1|B-cell stimulating factor-3|novel neurotroph|cardiotrophin-like cytokine factor 1|Novel neurotrophin-1

鹽酸普拉克索78.125-5000pg/mlCLS(Cardiolipin Synthase)|CRLS1|Protein GCD10 homolog

鹽酸普拉克索（標(biāo)準(zhǔn)品）0.156-10ng/mlc-myc|Myc|Myc2|Niard|Nird|avian myelocytomatosis viral oncogene homolog|BHLHE39|bHLHe39MRTL|Class E basic helix-loop-helix protein 39|c-Myc|myc proto-oncogene protein|myc-related translation|localization regulatory factor|Proto-oncogene c-Myc|Transcription factor p64|v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog|v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)

硫酸長春堿0.313-20ng/ml CNR1|CANN6|CB1|CB1A|CB1K5|CB1R|CB-R|CNR1|SKR6R|CANN6CB1R|cannabinoid receptor 1(brain)|CB1A|CB1K5|CB-RCB1cannabinoid receptor 1|central cannabinoid receptor|CNR

硫酸長春堿(標(biāo)準(zhǔn)品)62.5-4000pg/mlCNR2|CB2R|CNR2|CX5|cannabinoid receptor 2(macrophage)|CB-2|CB2cannabinoid receptor 2|CX5testis-dominant CNR2 isoform CB2|hCB2

硫酸長春堿(進(jìn)分)0.156-10ng/mlCNTN1|Contactin-1|Glycoprotein gp135|Neural cell surface protein F3

替莫唑胺0.313-20ng/mlCOL1|Alpha-1 type I collagen|Collagen alpha-1(I) chain

替莫唑胺(標(biāo)準(zhǔn)品)0.313-20ng/mlCOL10|COL10A1|Collagen alpha-1(X) chain|COL10-A1

氨魯米特0.156-10ng/mlCOL1α2|COL1A2|OI4

氨魯米特（標(biāo)準(zhǔn)品）62.5-4000pg/mlCOL2(Collagen Type Ⅱ)|Chondrocalcin|COL2A1|SEDC|Alpha-1 type II collagen|ANFH|AOM|cartilage collagen|COL11A3|Collagen 2|collagen alpha-1(II) chain|collagen II|alpha-1 polypeptide|collagen type 2

氟他胺0.625-40ng/mlCOL3|COL3α1|COL3A1|EDS4A|COL3A1|EDS4A|alpha1(III) collagen|Collagen 3|collagen alpha-1(III) chain|collagen|fetal|collagen|type III|alpha 1|Collagen-3|EDS4A|Ehlers-Danlos syndrome type IV|autosomal dominant

氟他胺（標(biāo)準(zhǔn)品）1.563-100ng/mlCOL4|Type-IV Collagen

環(huán)磷酰胺78-5000pg/mlCOL4α1|COL4A1|Collagen IV alpha 1|alpha-1 chain|arresten|COL4A1 NC1 domain|collagen alpha-1(IV) chain|collagen IV|alpha-1 polypeptide|Collagen-4

99%25mg1gN對(duì)香豆酰真蛸68224soluble Thrombomodulin

替拉扎明 質(zhì)量規(guī)格：>98% Tirapazamine(SR259075; Win59075; SR4233)

astragalin馬來溴苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人自身免疫調(diào)節(jié)因子(Autoimmune regulator)ELISA試劑盒 0.2ml

抗胰島細(xì)胞抗體EFCBP2  突觸結(jié)合蛋白2抗體規(guī)格:96T/48TButylated Hydroxytoluene規(guī)格:500mg白細(xì)胞介素12;23 p40檢測試盒20mg小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，3T3L1細(xì)胞1x10^6cells

99%100mg5g野甘草3836235tyrosine kinase with immunoglobulinlike and EGFlike domains 2

五味子酚 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 人程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)ELISA試劑盒人96T0.312-20 ng/mL大鼠垂草扁桃(VMA)ELISA試劑盒，英文名：VMA ELISA Kit

tuberostemonine布地奈德標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人芳香基硫酯酶D(ASD)ELISA試劑盒 0.2ml

核糖體、P抗體、IgG/M/AIQCD  IQCD蛋白抗體規(guī)格:96T/48T2tertButyl4hydroxyanisole規(guī)格:2g白細(xì)胞介素12 p40檢測試盒100mg小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，BALB/3T3 clone A31細(xì)胞1x10^6cells

>98%(GC)500g1g超化物歧化酶Dihydropyrimidine Dehydrogenase

 皮狀絲孢酵母 Trichosporon cutaneumTris-Glycine

進(jìn)口、分裝抗豬偽狂犬病抗體檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒5081367

>98%(GC)25g5g超化物歧化酶thymidylate synthetase

肉豆蔻甲酯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)) 質(zhì)量規(guī)格：>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) Methyl Myristate

進(jìn)口、原裝抗豬偽狂犬病GB抗體檢測試盒10gHuman/人Elisa試盒50820650

97%100g25g超化物歧化酶Endogenous secretory receptor for advanced glycation end products

 費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. lactis

Pick，s Broth Base B一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)高遷移率族蛋白1檢測試盒20mg輪狀病抗體檢測試盒HemagglutinatingvirusofJapanantibody