PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

白介素4誘導(dǎo)蛋白1(IL4I1)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)LSD1 (1E5-H2) Mouse mAb100 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2(IFITM2)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)ATP2A1/SERCA1 (L24) Antibody100 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2(IFITM2)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)HMGCS1 (D1Q9D) Rabbit mAb100 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2(IFITM2)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Phospho-Tie2 (Tyr992) Antibody100 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(IFITM3)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)CDC37 (D28H7) Rabbit mAb100 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(IFITM3)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific)20 ul

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(IFITM3)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific)100 ul

含跨膜Emp24蛋白運輸域蛋白1(TMED1)檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)Tie2 (AB33) Mouse mAb100 ul
霍亂弧菌139型探針法熒光定量PCR試劑盒鄰苯二甲酸丁芐酯(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman OxLDL(Oxidized low-density lipoprotein) ELISA Kit

鄰苯二甲酸丁芐酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑：甲醇)48T/96THuman NRN1(Neuritin) ELISA Kit

聯(lián)苯菊酯(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman MYOCD(Myocardin) ELISA Kit

聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=3%,基體：石油醚)48T/96THuman MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) ELISA Kit

芐嘧磺隆(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman MDH2(Malate dehydrogenase, mitochondrial) ELISA Kit

草除靈(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman LMAN2(Vesicular integral-membrane protein VIP36) ELISA Kit

仲丁醇(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman GDF5(Growth/differentiation factor 5) ELISA Kit

聯(lián)苯(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman MMP17(Matrix metalloproteinase-17) ELISA Kit

聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0ug/ml,基體：甲醇)48T/96THuman TEP1(Telomerase protein component 1) ELISA Kit

正丁酸(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman HSPG2(Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein) ELISA Kit

4-溴聯(lián)苯(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman CARTPT(Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein) ELISA Kit

對叔丁基苯酚(PTBP)(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman PICP(C-terminal propeptide of Collagen alpha-1(I)chain) ELISA Kit

3,4-苯并芘(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman COL1A1(Collagen Type I Alpha 1) ELISA Kit

1,3-丁二醇(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman COL2A1(Collagen alpha-1(II)chain) ELISA Kit

2-溴乙醇(標(biāo)準(zhǔn)品)48T/96THuman PIIINP(N-terminal propeptide of Collagen alpha-1(III)chain) ELISA Kit

96%5g5gRPN303B/N+尼龍膜[15cm*20cm 0.45u](Amersham[分])Prostate stem cell antigen

(AR) 質(zhì)量規(guī)格：>99.5%,AR Iodine

對照品西酞普蘭相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人解整合素樣金屬蛋白酶9(ADAM9)ELISA試劑盒 0.2ml

大鼠過氧化物酶體增殖子活化受體γ( PPARγ)ELISA KitRNF34  環(huán)指蛋白34抗體規(guī)格:96T/48TClofazimine規(guī)格:200mg芳香烴受體檢測試盒20mg人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞1x10^6cells

96%25g25g4614/25mm,0.45u一次性針頭式濾器(PALL)PGI2

 TAT肉湯/胰蛋白胨大豆卵脂聚山梨酯瓊脂/胰酶大豆卵脂聚山梨酯瓊脂/胰酪胨大豆卵脂聚山梨酯瓊脂/TAT Broth化妝品和藥品中微生物檢測250克國產(chǎn)/進(jìn)口

對照品西酞普蘭相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人抗存活素抗體(Anti-Survivin antibody)ELISA試劑盒 0.2ml

大鼠環(huán)胞霉素A(CSA)RNF20  環(huán)指蛋白20抗體規(guī)格:96T/48TClofibrate規(guī)格:25mg非受體型蛋白酪氨激酶檢測試盒20mg人乳腺上皮細(xì)胞，HMECGD細(xì)胞1x10^6cells

98%100g25gD阿拉伯糖Spexin

丹酚B;丹參酚B 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥98%,20mg/支 胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子抗體 Galectin-3 ELISA Kit 半乳糖凝集素3(Galectin-3)ELISA試劑盒

標(biāo)準(zhǔn)品,中藥標(biāo)準(zhǔn)品, 松柏

98%5g5gD阿拉伯糖secreted phospholipase A2X

倍;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品;有證書 訂購|咨詢 規(guī)格： 0.25g 一氧化合成酶-2抗體 αLA ELISA Kit α-乳清蛋白(αLA)ELISA試劑盒

標(biāo)準(zhǔn)品,中藥標(biāo)準(zhǔn)品, 二松屬素酯

95%25g25gD阿拉伯糖Porphyromonasgingivalis IgG antibody

 訂購|咨詢 規(guī)格： 100mg CD3抗體 SEMA6B ELISA Kit 信號素6B(SEMA6B)ELISA試劑盒

標(biāo)準(zhǔn)品,中藥標(biāo)準(zhǔn)品, 75,7二羥基雙氫黃酯
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。