醫(yī)藥無(wú)菌車(chē)間——潔凈板項(xiàng)目工程案例
項(xiàng)目名稱(chēng)：濟(jì)南瑞康醫(yī)藥無(wú)菌車(chē)間
應(yīng)用板材：潔凈板
應(yīng)用系統(tǒng)：直接粘貼
施工時(shí)間：2017年6月
簡(jiǎn)  介：濟(jì)南瑞康醫(yī)藥有限公司位于 臨港經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)機(jī)場(chǎng)路東側(cè)，是瑞康醫(yī)藥股份全資子公司。無(wú)菌車(chē)間裝修項(xiàng)目使用墻冠UV氟碳潔凈板共計(jì)2000㎡。
潔凈板特性
1.防火
  潔凈板用特種硅酸鈣板作為基板，燃燒性能達(dá)到GB8624A1級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求。當(dāng)室內(nèi)發(fā)生火災(zāi)時(shí)，能有效阻止火勢(shì)的蔓延，不會(huì)產(chǎn)生有毒煙霧，無(wú)火焰?zhèn)鬟f；
2.環(huán)保
  產(chǎn)品釋放量符合GB18580-2001E1級(jí)，生產(chǎn)過(guò)程不使用任何溶劑，可揮發(fā)性有機(jī)物（氡）＜200Bq/m3，無(wú)氨，無(wú)笨，放射性達(dá)到A類(lèi)裝修材料標(biāo)準(zhǔn)。不含石棉；
3.
  潔凈板具有良好的性，抵抗多種病菌(大腸、金葡萄球菌、白色)在板材表面的存活；
4.耐腐蝕
  潔凈板具有相當(dāng)?shù)牡挚购投雀黝?lèi)腐蝕性物質(zhì)的耐腐蝕性能，具有極強(qiáng)的耐酸、耐堿、的特性，包括各類(lèi)清潔劑、消毒液及其它等；
5.耐候
  基板品越，涂層經(jīng)過(guò)十一次紫外光固化工藝，板材耐候性能強(qiáng)，使用壽命長(zhǎng)達(dá)25年以上。具有防輻射、抗靜電性能。

無(wú)菌藥品是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的商品，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》2010修訂版(Good manufacturing practice，GMP)于2011年3月1日起正式頒布實(shí)施，對(duì)無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程控制提出了更為嚴(yán)格的要求，“應(yīng)當(dāng)限度的降低微生物、各種微粒和熱原的污染”，且“產(chǎn)品的無(wú)菌或其他質(zhì)量特性絕不能只依賴于任何形式的終處理或成品檢驗(yàn)(包括無(wú)菌檢查)”。因此，了解無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物負(fù)載情況，即微生物的種類(lèi)和分布情況，建立無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染溯源分析的有效方法具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
材料與方法
材料
培養(yǎng)基 
硫酸鹽液體培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)皿、胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)皿、TSA(加中和劑)接觸碟， 來(lái)源于成都生物制品研究所有限責(zé)任公司培養(yǎng)基室。
陽(yáng)性對(duì)照 
試驗(yàn)菌株[CMCC(B)26003]金葡萄球菌。
儀器 
默克MAS100 NT浮游菌檢測(cè)儀，Millipore Microfil微生物限度儀，無(wú)菌檢查電腦集菌儀，B×41光學(xué)成像顯微鏡，VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，生物安全柜。
主要試劑及耗材 
滅菌0.1%蛋白胨溶液、pH7.0無(wú)菌-蛋白胨緩沖液，自配；革蘭染色液，法國(guó)生物梅里埃公司；GN 卡、GP卡、BCL 卡、YST 卡，法國(guó)生物梅里埃公司。
方法
潔凈室環(huán)境及人員監(jiān)測(cè) 
對(duì)乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)操作潔凈室進(jìn)行浮游菌、沉降菌和設(shè)施設(shè)備及人員表面微生物動(dòng)態(tài)檢測(cè)，C級(jí)(含局部層流) 每周一次，D級(jí)每月一次。表面微生物測(cè)試: 采用接觸碟法，即TSA(加中和劑)培養(yǎng)基充滿碟子并形成圓弧頂，取樣面積為 25 cm2，取樣時(shí)打開(kāi)碟蓋，無(wú)菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板10s左右，確保培養(yǎng)基表面與取樣點(diǎn)表面均勻充分接觸，再蓋上碟蓋。然后將采樣后平皿先倒置于20～25℃恒溫培養(yǎng)箱(室)中培養(yǎng)3d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，再倒置于30～35℃恒溫培養(yǎng)箱(室)中培養(yǎng)2～3d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并判定結(jié)果。
微生物限度 
對(duì)乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)車(chē)間用水和純化水系統(tǒng)水點(diǎn)每周取樣一次，并使用 Millipore Microfil微生物限度儀進(jìn)行檢測(cè)。
無(wú)菌檢查 
對(duì)2012年度生產(chǎn)的乙型腦炎減毒活疫苗所有批次中間產(chǎn)品使用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查。
菌型分析 
采用菌落形態(tài)特征觀察、革蘭染色鏡檢以及使用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物儀對(duì) 2012 年度以上3項(xiàng)所獲的微生物進(jìn)行分析。
結(jié)果
潔凈室環(huán)境及人員
2012年1月至12月潔凈區(qū)環(huán)境微生物檢測(cè)包括浮游菌、沉降菌、設(shè)施設(shè)備及人員表面微生物檢測(cè)，

制藥無(wú)菌車(chē)間潔凈車(chē)間裝修設(shè)計(jì)
隨著不斷循環(huán)每次去除水分越來(lái)越少，干燥間內(nèi)濕度越來(lái)越低。以此方法可以將干燥間內(nèi)濕度降到20% 以下，達(dá)到器皿干燥的目的。
2.4.2 合理的加熱及保溫溫度設(shè)計(jì)
從表1 中可以看出，提高干燥間保溫溫度達(dá)60℃，吸收器皿中水分，設(shè)置循環(huán)同樣時(shí)間達(dá)到濕度80%，空氣中水分為103.7g/m3，一次排放水量可達(dá)(103.7g/m3-11.4g/m3)x120 g=11076g，是保溫45℃情況4896g 的1 倍以上，除濕效率更高?？梢?jiàn)，干燥間的保溫是很關(guān)鍵的。
但因?yàn)楦稍镩g周?chē)臐崈魪S房溫度一般為20℃，如果干燥間溫度設(shè)置過(guò)高，溫差太大，散熱也很大，熱損失較大，需要的加熱功率過(guò)大，加熱段溫度太高，安全風(fēng)險(xiǎn)過(guò)大，故一般保溫循環(huán)溫度設(shè)定在45℃-60℃較好。通常冬季設(shè)為45℃，夏季設(shè)為60℃。
由表1，可知即便是濕度達(dá)到，室外溫度15℃時(shí)， 大氣中水分含量為m1=12.7g/m3。加熱循環(huán)至45℃， 多次置換排放后濕度為20%，空氣中水分含量為m2=13.0g/m3，m2>m1，說(shuō)明此時(shí)通過(guò)純加熱除濕方式可以實(shí)現(xiàn)終濕度低于20% 的結(jié)果。
2.5 綜合干燥除濕
2.5.1 綜合干燥除濕的原因
夏季極端情況下，室外溫度35℃以上，濕度 時(shí)，查表1 可知，此時(shí)空氣中水分含量將＞40g/m3。如單純用加熱排放，對(duì)應(yīng)40g/m3的水分含量，干燥間內(nèi)循環(huán)溫度45℃，濕度＞ 60%；循環(huán)溫度50℃，濕度接近50%；55℃，濕度接近40%；即便溫度達(dá)到60℃濕度也超過(guò)30%，此時(shí)難于達(dá)到干燥的目的。
所以，在夏季極端情況下，置換室外空氣時(shí)，應(yīng)該對(duì)室外高溫高濕空氣首行降溫除濕，使空氣中水分含量由40g/m3先降至15g/m3-20g/m3， 去除多25g/m3水分， 再加熱升溫循環(huán)至對(duì)應(yīng)5055℃-55℃，即可將終濕度控制在20% 以下，達(dá)到干燥的目的。
2.5.2 表冷器制冷量的計(jì)算
根據(jù)前面所述，新風(fēng)補(bǔ)風(fēng)量V=2500m3/h，新風(fēng)中水含量M=40g/m3，單位時(shí)間處理水量m=MV,=2500m3/hX40 g/m3=100Kg/h
過(guò)程中需要將35℃新風(fēng)降至10℃， 溫差ΔT=25℃
水熱容量C=1cal/g℃，
需要冷量Q=mCΔT=100Kg/hX1cal/g℃X25℃=2500Kcal/h
再考慮表冷器的交換效率如果為50%，則冷量需要量應(yīng)為5000 Kcal/h。
3 程序控制
潔凈除濕干燥系統(tǒng)的運(yùn)行，涉及新風(fēng)、送回風(fēng)風(fēng)閥開(kāi)關(guān)、溫濕度采集、空氣中水分含量、時(shí)間參數(shù)計(jì)算對(duì)比控制、加熱、制冷、風(fēng)機(jī)無(wú)風(fēng)保護(hù)、過(guò)熱保護(hù)、各種運(yùn)行方式切換等控制，所以我們選用了西門(mén)子S7-200PLC 編程控制器，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)與系統(tǒng)連接，可以實(shí)現(xiàn)在線和遠(yuǎn)程雙重控制。
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無(wú)菌藥品制作車(chē)間 裝修凈化
中間產(chǎn)品無(wú)菌檢查陽(yáng)性結(jié)果及溯源分析舉例
2012年度共收檢乙型腦炎減毒活疫苗中間產(chǎn)品無(wú)菌檢查1731批次，其中陽(yáng)性結(jié)果35 批次，占2.02% 。經(jīng)分離純化培養(yǎng)和菌型鑒別分析，主要存在里拉/藤黃微球菌、蠟樣芽胞及奇異變形菌等，舉例溯源分析如下: 
①里拉 /藤黃微球菌檢出3例。里拉/藤黃微球菌為潔凈區(qū)環(huán)境及人員監(jiān)測(cè)主要菌群，而在水系統(tǒng)樣品中并未檢出，故推斷為操作過(guò)程中經(jīng)環(huán)境帶入；
②蠟樣芽胞檢出3例。蠟樣芽胞在水系統(tǒng)中全年僅檢出1次，而在環(huán)境監(jiān)測(cè)中檢出83次(占11.05%)。蠟樣芽胞的生長(zhǎng)溫度范圍為20～45℃，10℃以下生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)，50℃時(shí)不生長(zhǎng)，在100℃下加熱20min即被破壞。而所有的工藝用水均經(jīng)過(guò)高壓滅菌(121℃，30min)處理。因此推斷，蠟樣芽胞應(yīng)仍為操作過(guò)程中經(jīng)環(huán)境帶入；
③奇異變形檢出4例，由于截止目前潔凈區(qū)環(huán)境及人員和水系統(tǒng)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)中均未曾檢出此類(lèi)菌，故排查分析只可能是工藝操作本身引入。據(jù)查閱資料，奇異變形一般廣泛存在于水、土壤的有機(jī)物以及人和動(dòng)物的腸道。故根據(jù)工藝操作特點(diǎn)進(jìn)行推測(cè)，很可能來(lái)自無(wú)特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)地鼠取腎操作工藝。故對(duì)此批工藝剩留的末次腎塊洗滌液取樣進(jìn)行無(wú)菌檢查檢測(cè)，證實(shí)為SPF地鼠取腎操作不慎帶入。
討論
從菌型分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)可知，該潔凈區(qū)環(huán)境和人員主要存在革蘭陽(yáng)性球菌如里拉/藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等，共占78.56% 以上，其次為蠟樣芽胞和少量的庫(kù)克菌及霉菌等。另外，對(duì)于霉菌從檢測(cè)時(shí)間和空間上看，主要集中出現(xiàn)在春、夏季節(jié)，潔凈區(qū)較潮濕的精洗場(chǎng)和細(xì)胞水浴加溫潔凈室。因此宜在春、夏季節(jié)加強(qiáng)工藝濕度較大潔凈室霉菌的消殺處理。
封閉的用水(80℃保溫循環(huán))和純化水(20℃保溫循環(huán))管道環(huán)境條件較差，檢出的微生物種類(lèi)和數(shù)量均較少，經(jīng)鑒別分析主要存在少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、皮氏羅爾斯頓菌等革蘭陰性菌以及芽胞等。
溯源分析舉例表明，根據(jù)初步建立的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)以及中間產(chǎn)品無(wú)菌檢查陽(yáng)性菌型分析結(jié)果可以比較明確地確定產(chǎn)品污染的來(lái)源，2012 年乙型腦炎減毒活疫苗中間產(chǎn)品無(wú)菌試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，主要為操作過(guò)程中經(jīng)環(huán)境偶然帶入以及地鼠取腎操作不慎帶入。
雖然該中間產(chǎn)品并不是無(wú)菌工藝操作(半成品配制時(shí)需經(jīng)0.22μm薄膜過(guò)濾)，但盡量控制本底污染對(duì)于實(shí)施GMP控制具有積極的意義。奇異變形全年檢出4例，且無(wú)菌檢查時(shí)均能在觀察結(jié)果前2～3d就發(fā)現(xiàn)樣品染菌(無(wú)菌檢查孵放要求是培養(yǎng)14d)，相關(guān)批次單一收獲物均報(bào)廢處理。從無(wú)菌風(fēng)險(xiǎn)和生產(chǎn)成本來(lái)看，該產(chǎn)品工藝中取腎操作是需關(guān)注的重點(diǎn)，可通過(guò)加強(qiáng)員工現(xiàn)場(chǎng)操作培訓(xùn)和考核以及進(jìn)一步優(yōu)化該步工藝操作等實(shí)現(xiàn)。
另外，2012年中間產(chǎn)品無(wú)菌檢查陽(yáng)性結(jié)果還檢出放射根菌、苛養(yǎng)顆粒鏈菌、斯氏普羅威登斯菌等少數(shù)微生物種類(lèi)，全年各僅檢出一例，且暫未在建立的潔凈區(qū)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)，目前還無(wú)法確切地追溯其來(lái)源。
由于全面開(kāi)展菌型分析工作僅一年多時(shí)間，且乙型腦炎減毒活疫苗工藝較為復(fù)雜，涉及到SPF 地鼠操作，今后將根據(jù)工藝特點(diǎn)建立SPF地鼠如腸道、皮毛等部位的微生物基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，以完善來(lái)源追溯途徑，進(jìn)一步提高GMP操作水平。