柱式動(dòng)物線粒體DNAout，PCR級

產(chǎn)品及特點(diǎn) 線粒體 DNA（mtDNA）是進(jìn)行分子進(jìn)化研究和母性遺傳研究的重要材料，但傳統(tǒng)的兩步式 mtDNA 提取方法是先溫和裂解細(xì)胞，分離線粒體，然后再從線粒體中提取 mtDNA。此方法中的溫和裂解細(xì)胞的條件十分難以控制，需要針對不同組織材料單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化。本方法克服了上述缺點(diǎn)，具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1. 不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。

3. 每 107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克組織一般能得到 3-5 ug mtDNA。

4. 注意：本產(chǎn)品只適合于動(dòng)物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體 DNA一般都十分巨大，非常難提。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大扁盒包裝 
柱式動(dòng)物線粒體 DNA 提取溶液 A 80803A 13 mL 柱式動(dòng)物線粒體 DNA 提取溶液 B 80803B 13 mL 柱式動(dòng)物線粒體 DNA 提取溶液 C 80803C 18 mL 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL DNA 洗脫液 70705 10 mL 使用手冊 80803sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，短期可以在室溫放置；長期保存最好放 4℃。

自備試劑 無

使用方法 

一：培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理

1. 用自備的 0.25%胰酶消化液處理約 107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，離心收集后棄上清。

2. 用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA 提取。

二：組織細(xì)胞預(yù)處理

3. 用剪刀將 1g 新鮮的動(dòng)物組織剪碎（芝麻大小最好），轉(zhuǎn)移到 1.5mL 塑料離心管中，用于 mtDNA 提取。注意：最好不要使用凍存的動(dòng)物組織，因?yàn)閮瞿^程中形成的冰晶會將線粒體刺破，使其 DNA 釋放出來被胞漿中的 DNA 酶降解，影響回收率。

三：血液預(yù)處理

4. 將 3-5 mL 抗凝外周血靜置 30 分鐘或低速離心 5 分鐘，取白細(xì)胞層。

5. 用自備 PBS 洗滌白細(xì)胞兩次，得到的白細(xì)胞沉淀用于 mtDNA 提取。四：mtDNA 提取

5. 在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入 250 uL 冰浴的溶液 A，充分吹打分散。如果是剪碎的組織，不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入 250 uL 常溫的溶液 B（如果溶液 B 有沉淀，用前須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻 10 次。千萬不要?jiǎng)×艺袷帯?/p>

7. 冰上放置 6-8 分鐘。注意不要超過 8 分鐘。

8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C，溫和混勻 4-6 次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，然后放冰上放置 20-25 分鐘。

9. 室溫 12000-15000 g 離心 10 分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大，有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象，取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置 5 分鐘以讓 DNA 與離心吸附柱充分結(jié)合，此步十分重要。

11. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，棄收集管中的廢液。

12. 加入 500 uL 的通用洗柱液，室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會揮發(fā)。

13. 重復(fù)上步 1 次。

14. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會影響 DNA 的后續(xù)使用（如 DNA 上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中）。

15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中，加入 30-50 uL65-80℃預(yù)熱的 DNA 洗脫液，室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。

16. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，離心管底溶液即 mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合 DNA 能力較強(qiáng)，如果再加 30-50 uL DNA 洗脫液到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多 mtDNA（相當(dāng)于第一次洗脫的 20-30%），但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液來洗脫。

18. 12000-15000 g 離心 1 分鐘，離心管底溶液即線粒體 DNA。每 107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克組織一般能得到 3-5 ugmtDNA。如果 DNA 需要濃縮，可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于 DNA 機(jī)械斷裂，電泳時(shí) DNA 可能不呈現(xiàn)專一的帶，但此 mtDNA 溶液可以直接用于 PCR。