一站式MBP標(biāo)簽蛋白純化套裝/KLANG
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一站式MBP標(biāo)簽蛋白純化套裝-KLANG

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≥1

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≥5

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商品參數(shù)
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商品介紹
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是否進(jìn)口
分類 分子生物學(xué)
貨號(hào) KL130871-20
級(jí)別
含量 99%
產(chǎn)品規(guī)格 20次
品牌 康朗生物/KLANG
用途范圍 用于 DNA 提取、RNA 提取等后續(xù)實(shí)驗(yàn)
特色服務(wù) 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。
產(chǎn)品名稱 一站式MBP標(biāo)簽蛋白純化套裝
是否危險(xiǎn)化學(xué)品
商品介紹

一站式MBP標(biāo)簽蛋白純化套裝

產(chǎn)品及特點(diǎn)MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白,Maltose Binding Protein)標(biāo)簽蛋白大小為 40kDa,由大腸桿菌 K12 的 malE 基因編碼。MBP 可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá),MBP 可以融合在蛋白的 N 端或 C 端。MBP 融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化,結(jié)合的融合蛋白可用 10 mM 麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。如果要去除 MBP 融合部分,可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。可用 MBP 抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè) MBP 標(biāo)簽標(biāo)記的重組蛋白。由于 MBP 融合蛋白原核表達(dá)載體具有表達(dá)效率高,易于純化等優(yōu)點(diǎn)。在現(xiàn)代分子克隆中 MBP 常作為融合蛋白被廣泛應(yīng)用。本產(chǎn)品就是專門(mén)用于分離純化 MBP 融合蛋白的試劑盒,它具有下列特點(diǎn):

1. 一站式套裝,含所需的直鏈淀粉和瓊脂糖介質(zhì)、溶液和層析柱,操作非常方便。

2. 提供 2 mL 直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì),其最大載量為 10 mg MBP 蛋白/mL介質(zhì)。

3. 采用麥芽糖溫和洗脫,無(wú)去污劑和變性劑對(duì)蛋白活性的影響。

4. 本試劑盒足夠 20 次制備,但介質(zhì)可以反復(fù)使用更多次(需要復(fù)活)。
規(guī)格及成分 成份 編號(hào) 大紙盒包裝
直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì) LM130871A 2 mL
1 M Tris-HC(l pH 7.4) 25-07640 25 mL
0.1 M EDTA 溶液 131181 25 mL
2 M NaCl 溶液 25-06280 50 mL
蔗糖 57-50-1 20 g
PMSF(10 mg/mL) 100833 1 mL
0.1 mM MgCl2溶液 130871B 50 mL
0.1 M 麥芽糖溶液 130871C 25 mL
層析柱(6 mL) 110809 1 支
使用手冊(cè) 130871sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存,但介質(zhì)需 4℃保存,PMSF 需要-20℃保存,有效期一年。

自備試劑 去離子水、20%乙醇、0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜


使用方法 1. 將直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后,取適量加入到預(yù)放了一片篩板的層析

柱中(介質(zhì)用量需要根據(jù) MBP 蛋白產(chǎn)量決定,其最大載量為 10 mg MBP

蛋白/mL 介質(zhì),請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取適量的介質(zhì)加入層析柱中)。

2. 用 5 倍柱體積(柱體積指的是填料介質(zhì)的體積,下同,本試劑盒介質(zhì)的體積

是 2mL)自備去離子水洗柱,共 3 次。

3. 用 5 倍柱體積(約 10mL)的新配的結(jié)合緩沖液洗柱,進(jìn)行平衡,使填料介

質(zhì)處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,起到保護(hù)蛋白的作用。結(jié)合緩沖液的

配方如下(以 10 mL 為例):

成分 用量 在結(jié)合緩沖液中的濃度

1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.2 mL 20 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM

2 M NaCl 溶液 1 mL 200 mM

自備去離子水 8.7 mL - 4. 4℃ 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液,棄上清,將細(xì)胞沉淀(約

100 mg)懸于 2 mL 冰冷的現(xiàn)配的細(xì)胞洗滌液中,4℃ 5000 g 離心 15 分

鐘收集細(xì)胞沉淀后,再次懸于 2 mL 冰冷的細(xì)胞洗滌液中。(最好用不加誘

導(dǎo)物的菌液做對(duì)照樣。)細(xì)胞洗滌液的配方如下(以 10 mL 為例):

成分 用量 在細(xì)胞洗滌液中的濃度

1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.1 mL 10 mM

2 M NaCl 溶液 0.15 mL 30 mM

自備去離子水 9.75 mL - 5. 制備細(xì)胞裂解物:

1) 如果所用載體不帶 MBP 信號(hào)肽序列(如 pMAL-c2)

a) 超聲破碎細(xì)胞,功率 30 W,保持細(xì)胞低溫(0℃),直到在顯微鏡

下看見(jiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。(超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號(hào)自行摸索,

但裂解物必須不粘稠,否則會(huì)堵塞層析柱。)

b) 為使溶液澄清,向上述細(xì)胞洗滌液中加入 35 uL PMSF(10

mg/mL)。

c) 4℃下 13000-15000 g 離心 30 分鐘,以去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片

以防堵柱,收集上清樣品,留樣做 SDS-PAGE 電泳對(duì)照,其余樣

品用于純化 MBP 融合蛋白,直接進(jìn)入第 6 步。

2) 如果所用載體帶 MBP 信號(hào)肽序列(如 pMAL-p2)

a) 4℃ 5000 g 離心 15 分鐘收集細(xì)胞,沉淀懸于 1 mL 冰冷的現(xiàn)配

的細(xì)胞裂解液中。細(xì)胞裂解液的配方如下(以 10 mL 為例):

成分 用量 在細(xì)胞裂解液中的濃度

1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.3 mL 30 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.01 mL 0.1 mM

蔗糖 2 g 20%(m/V)

自備去離子水 加水到 10 mL - b) 加入 25 uL PMSF(10 mg/mL),室溫?cái)噭?dòng) 15 分鐘,于 4℃

13000-15000 g 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。

c) 旋動(dòng)細(xì)胞沉淀,加入 2 mL 冰冷的 0.1 mM MgCl2溶液,4℃攪動(dòng)

10 分鐘。

d) 休克細(xì)胞 4℃ 13000-15000 g 離心 10 分鐘,在上清中加入 10

mM Tris-HCl(pH 7.4)(可將 1 M Tris-HCl,pH 7.4 稀釋 100

倍配制而成)至 pH 為 7.4。

e) 上清用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過(guò)濾,濾液用 100 倍體積的

10 mM Tris-HCl(pH 7.4)(配方如上)4℃透析。

f) 收集透析后樣品,留樣做 SDS-PAGE 電泳對(duì)照,其余樣品用于純

化 MBP 融合蛋白,直接進(jìn)入第 6 步。

6. 將樣品加到平衡好的直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)中(保證目的蛋白與介質(zhì)充分接

觸,以提高目的蛋白的回收率),收集流出液。

7. 用 10-15 倍柱體積的結(jié)合緩沖液(配方見(jiàn)上表)進(jìn)行清洗,去除非特異性

吸附的雜蛋白,收集洗雜液。

8. 使用 5-10 倍柱體積的現(xiàn)配的麥芽糖洗脫液洗脫結(jié)合的融合蛋白,收集洗脫

液(即目的蛋白組分)。麥芽糖洗脫液的配方如下(以 10 mL 為例):

成分 用量 在麥芽糖洗脫液中的濃度

1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.2 mL 20 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM

0.1 M 麥芽糖溶液 1 mL 10 mM

自備去離子水 8.7 mL - 9. 將純化得到的樣品(包括流出液、洗雜液和洗脫液)以及原始樣品使用

SDS-PAGE 檢測(cè)純化效果。

10. 填料介質(zhì)清洗:依次使用 3 倍柱體積的結(jié)合緩沖液和 5 倍柱體積的去離子

水平衡介質(zhì),最后再用 5 倍柱體積的 20%的乙醇平衡,然后保存在等體積

的 20%的乙醇中,置于 4℃保存,防止填料被細(xì)菌污染。本介質(zhì)可重復(fù)使

用。 蛋白酶切割釋放靶蛋白(可選步驟,所用試劑需自備)

11. 用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈钊诤系鞍揍尫虐械鞍住?/p>

1) 加入自備的凝血酶、腸激酶或 Xa 因子(根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇)。

每毫升介質(zhì)中加入 50 單位的溶于 1 mL PBS 溶液的蛋白酶。顛倒離心

管數(shù)次混勻,室溫下振蕩 2-16 小時(shí)。

2) 4℃以 500 g 離心 5 分鐘,上清小心轉(zhuǎn)移到新離心管中。

3) 用傳統(tǒng)的層析方法或 SDS-PAGE 電泳分離靶蛋白和蛋白酶。


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公司名稱 上海康朗生物科技有限公司
聯(lián)系賣家 蔡經(jīng)理 (QQ:3002763590)
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