細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)

    水溶性四唑（2-（2-甲氧基-4 硝基.苯）-3-(4-硝基.苯)-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽），是一種類似于MTT 的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料(formazan,下圖)， 這種甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。水溶性四唑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠。細(xì)胞增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。正是利用這一特性開發(fā)的CCK-8 試劑盒直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

CCK-8 法與 MTT 比較：

    CCK8 試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全，重現(xiàn)性好的細(xì)胞增殖與活性檢測方法。與傳統(tǒng)的MTT 相比無需有機(jī)溶劑和放射性同位素，步驟少，無損失，結(jié)果準(zhǔn)確！

1. MTT 實(shí)驗(yàn)生成的甲臜不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，不僅省去了溶解的步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

2. 與MTT 方法相比，本方法線性范圍更寬，靈敏度更高。

3. 本方法對細(xì)胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時(shí)間。

4. 本方法所用試劑在培養(yǎng)基中比MTT 更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)效果重復(fù)性好。

5. MTT 具有毒性，同時(shí)其生成的甲臜需要有機(jī)溶劑溶解，會對操作人員身體造成危害。本試劑無毒，使用中無需有機(jī)溶劑，操作更加安全。

6. 本試劑盒在4℃避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。

	CCK-8 法	MTT 法
1	還原后的Formazan 是水溶性的 （不需要溶解）	還原后的Formazan 是非水溶性的 （需要加有機(jī)溶劑溶解）
2	重現(xiàn)性好	重復(fù)性差
3	操作簡單	操作繁瑣
4	測定波長：450～490nm	測定波長：550～600nm
5	為1 瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用	由于需要加有機(jī)溶劑溶解，工作量大

 

用途：

CCK-8 試劑盒可以用于生物活性因子的活性檢測，抗腫瘤藥物的篩選，細(xì)胞增值的測定，細(xì)胞毒性檢測以及藥敏等與細(xì)胞活性和增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經(jīng)配制好的含有水溶性四唑的CCK-8 溶液，即開即用，無需其他準(zhǔn)備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用96 孔板或者384 孔板在酶標(biāo)儀上檢測，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測。

 

保存條件：

CCK-8 溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年，如長期保存，可在-20℃下保存2 年；如需經(jīng)常使用請將試劑存放在0-5℃，為防止背景值增加干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請勿反復(fù)凍融。

 

CCK-8使用方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

2、按比例(例如:1/2 比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6 個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4 小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK 試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，OD 值為縱坐標(biāo) (Y 軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(適用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK 后的培養(yǎng)時(shí)間要一致)

二、細(xì)胞活性檢測

1、在96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37 °C,5% CO2 的條件下）。

2、向每孔加入10 μL 的CCK 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm 處的吸光度。

5、如果暫時(shí)不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

二、細(xì)胞活性檢測

1、在96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37 °C,5% CO2 的條件下）。

2、向每孔加入10 μL 的CCK 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm 處的吸光度。

5、如果暫時(shí)不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

三、細(xì)胞增值-毒性檢測

使用方法（以96 孔板為例，其他規(guī)格培養(yǎng)板按實(shí)際情況安排）：

1. 在96 孔板中配置100μl 的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100μl 2000 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100μl5000 個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行培養(yǎng)（在37 °C，5%CO2,，的條件下）預(yù)培養(yǎng)24 小時(shí)。

2. 向培養(yǎng)板加入1-10μl 不同濃度的待測藥物刺激。

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（后面有具體細(xì)胞的建議時(shí)間，例如：6、12、24 或48 小時(shí)）。

4. 每孔加入10μlCCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl CCK-8 溶液，其他情況以此類推?？梢杂眉恿讼鄳?yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8 溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8 溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。

5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4 小時(shí)，對于大多數(shù)情況孵育1 小時(shí)就可以了。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2 和4 小時(shí)候分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6. 用酶標(biāo)儀測定在450nm 處的吸光度，如無450nm 濾光片，可以使用420-480nm 的濾光片?？梢允褂么笥?/span>600nm 的波長，例如650nm，作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

7. 如果暫時(shí)不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

8. 注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。