組織細胞含硒谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒      E2012

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價格（元）
E2012	組織細胞含硒谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒	100次	760

儲存條件：-20℃儲存，一年有效。NADPH配制成溶液后，可適當分裝，-70℃儲存。GSH溶解后，-20℃儲存。

操作步驟：

1. 樣品的準備

1.1 細胞樣品的準備：收集新鮮細胞，PBS洗滌細胞一次，離心收集細胞，吸盡上清。加入200 μl細胞裂解液裂解細胞，冰浴30分鐘。4℃，10000g離心10分鐘。取上清進行蛋白濃度定量后用于谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性超出測定范圍，可利用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液適當稀釋后測定，稀釋倍數(shù)請通過預(yù)實驗確定。

1.2 組織樣品的準備：利用含1mM EDTA的PBS灌流或漂洗組織，去除組織中的血液，然組織樣品約20 mg，加入細胞裂解液400μl，冰浴勻漿。4℃，10000g離心10分鐘。取上清進行蛋白濃度定量后用于谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性超出測定范圍，可利用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液適當稀釋后測定，稀釋倍數(shù)請通過預(yù)實驗確定。

2. 試劑盒的準備

2.1 GSH儲備液的配制：在本試劑盒提供的12 mg GSSG中加入1ml的純水，溶解并混勻，即為GSH儲備液，濃度為40 mM。

2.2 NADPH儲備液的配制：在本試劑盒提供的15mg NADPH中加入0.9ml純水，溶解并混勻，即為NADPH儲備液，濃度為20 mM。

2.3谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液的配制：根據(jù)待測樣品數(shù)參考下表配制適當量的谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液，表中試劑按比例混合后即為谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液。

2.4過氧化物工作液的配制：取20 μl過氧化物試劑（t-Bu-OOH）加入5ml純水中，混勻，然后根據(jù)需要取部分t-Bu-OOH水溶液，利用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋10倍，

即為過氧化物工作液。

注：稀釋過的過氧化物水溶液或過氧化物工作液可冰浴保存請勿超過6 h。

3. 標準品的準備

將20mM的NADPH儲備液用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋成500、250、125、62.5、31.2、15.6 μM濃度的NADPH溶液，用于標準曲線測定。在本試劑盒相同反應(yīng)體系下NADPH標準曲線只需要測定1次。

4. 測定方法

4.1   NADPH標準曲線測定：利用上述系列濃度NADPH標準品，各取200μl到96孔板中，各孔加入NADPH量分別為100、50、25、12.5、6.2、3.1 nM，測定A_340nm。

4.2   參考下表，使用96孔板，依次加入谷胱甘肽還原酶檢測工作液、樣品后，混勻，25℃或室溫孵育2分鐘。

 

4.3   各孔加入過氧化物工作液50μl，25℃孵育20分鐘。

4.4 各孔加入過氧化物工作液50μl啟動谷胱甘肽過氧化物酶反應(yīng)后，立即開始計時，并在2.5、5、10、20分鐘等時間點測定A_340nm。如果樣品吸光度下降過快，可適度稀釋樣品后測定；如果樣品吸光度下降過慢，可適當延長反應(yīng)時間進行樣品測定。

5. 數(shù)據(jù)處理

利用NADPH標準品的量為橫坐標，吸光度值為縱坐標制作標準曲線，并獲得橫縱坐標之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用各樣品的吸光度值計算樣品中剩余的NADPH量，從而換算為谷胱甘肽過氧化物酶活力。對于細胞和組織樣品，可以根據(jù)樣品中蛋白濃度測定，計算每毫克蛋白中谷胱甘肽過氧化物酶活力。由于有多個時間點的測定，可以選擇時間線性良好的時間段計算谷胱甘肽過氧化物酶活力。

谷胱甘肽過氧化物酶定義：在25℃，pH 7.2條件下，每分鐘將1.0μmol的還原型谷胱甘肽氧化為氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽過氧化物酶為1 U，1 U=1000 mU。