描述：TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TRITC紅色熒光標(biāo)記，通用型)提供一種高靈敏度又快速簡便的細(xì)胞凋亡檢測方法，可檢測細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，其原理是紅色熒光素（Tetramethylrhodamine，TRITC）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3′－OH末端，可用熒光顯微鏡檢測。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有 3′-OH 形成，很少能夠被標(biāo)記。

適用范圍：本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或爬片）的凋亡原位檢測。對于經(jīng)過固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應(yīng)，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡檢測到凋亡細(xì)胞。

規(guī)格及儲存：（50T） 10×Proteinase K    500μL -20℃保存  一年有效

DNaseⅠ(50U/ ul)   500μL -20℃保存  一年有效

DNaseⅠBuffer     500μL   -20℃保存  一年有效

Equilibration Buffer  2.5ml   -20℃保存  一年有效

TdT Enzyme        200μL  -20℃保存  一年有效

Biotin-11-Dutp      50μL   -20℃b避光保存  一年有效

Streptavidin-TRITC  250μL  4℃避光保存      一年有效

Labeling Buffer     2.5ml   4℃保存          一年有效

需要用到的儀器和其他試劑：實驗前按說明書準(zhǔn)備好相應(yīng)試劑與器具，多聚甲醛、二甲苯、乙醇、1×PBS pH 7.4、H2O2、Triton X-100、甲  醇、多聚賴氨酸鋪載玻片（細(xì)胞樣本）、蓋玻片、染色缸、溫盒、量筒等。

操作步驟：

注意：

1、各個樣本請用免疫組化筆做好標(biāo)記，另外加 2 張樣本切片分別用于陽性片和陰性片制備并做好標(biāo)記。

2、在每步反應(yīng)或浸洗的間隙時，配制下一步即用的工作液。

1、樣本處理：

細(xì)胞涂片或冰凍切片：1、將自然晾干的細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或爬片）或冷凍切片浸入盛有4%多聚甲醛固定液的染色缸，室溫固定20-30 min；2. 樣本片浸入1×PBS洗三次，每次5min；

石蠟切片：1、石蠟切片按常規(guī)方法進行脫蠟，60℃烘片60min。二甲苯脫蠟2 次，乙醇水合（100%、95%、80%、75%）；每次5min；2. 切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；

2、通透：

組織樣品：配Proteinase K工作液：計算樣本數(shù)量集中配制，每樣本90 ul 1×PBS加10ul 10×Proteinase K，即用即配；每樣本上滴加 100 ul Proteinase K 工作液，37℃反應(yīng) 15-20min；

細(xì)胞貼壁樣本：建議用預(yù)冷的 100 ul 1%Triton X-100/10mM PBS 處理 5 分鐘（細(xì)胞樣本）。

3、切片浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5min。

（注：根據(jù)樣本情況，本步驟可用微波方法：將切片置于 pH6.0 檸檬酸鹽緩沖液中，中高火 8min后晾涼）

4、制作陽性片：

（注意：陽性片只針對實驗體系進行設(shè)置對照，不需要每片制備）根據(jù)樣本類型不同，配制100ul含不同活性單位U的DNaseⅠ反應(yīng)液，方法如下：

樣本 細(xì)胞樣本 冷凍切片 石蠟切片

U /100 ul 1000U-2000U     2000 U-3000 U        3000U-5000U

DNaseⅠ(50U/ ul) 用量 20ul-40ul       40ul-60ul           60ul-100ul

DNaseⅠBuffer 用量 80ul-60ul       60ul-40ul            40ul-0ul

4.1在一張樣本片上滴加100ul上述配制好的DNaseI反應(yīng)液，37℃處理30min；

4.2上述陽性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；

5、連接

5.1 配制 TdT 酶反應(yīng)液：計算樣本數(shù)量集中配制（陰性對照片不計入），每個樣本用量為：在45ul Equilibration Buffer 加入1.0ul biotin-11-dUTP 和4.0ul TdT Enzyme，即用即配，注意避光；

5.2 樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50ul TdT酶反應(yīng)液，放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)60min（注：陰性對照樣本不加TdT酶反應(yīng)液）；

5.3反應(yīng)后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，注意避光；

5.4 配置Streptavidin-TRITC工作液：Streptavidin-TRITC試劑按每張切片5ul 用量與45ul Labeling Buffer混勻，計算所需的總量，即用即配，注意避光。

5.5 樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50 ul 配置好的Streptavidin-TRITC工作液，放入濕盒，37℃避光反應(yīng)30 min。

5.6 反應(yīng)后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，每次 5min，注意避光；

5.7 DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)10min。洗去DAPI染液，加適量體積比封片劑（甘油：PBS=6：4）。

6、檢測

熒光顯微鏡檢測：激發(fā)波長543nm，發(fā)射波長571nm。（注：熒光易淬滅，請盡快觀察拍照）

注意事項：

1、 反應(yīng)液最好根椐計算好的樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本，避免因每個樣本單獨配制而產(chǎn)生的試劑損耗。

2、 TdT酶反應(yīng)液如需短暫保存時，請置于冰上。

3、 操作 Streptavidin-TRITC 時注意避光。