描述：乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑的關(guān)建酶，存在于大多數(shù)組織的細(xì)胞內(nèi)液中，在組織液和細(xì)胞外液中的含量很低。例如紅細(xì)胞中LDH的活性比血清中高約100倍，而血液LDH的活性是臨床診斷和醫(yī)學(xué)研究中常用的生化指標(biāo)。另一方面，LDH可從立體培養(yǎng)細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中，其釋放量可反映細(xì)胞經(jīng)受物理因素或藥物處理的損傷程度，常用來評(píng)估組織細(xì)胞損傷及藥物毒性。培養(yǎng)基LDH活性監(jiān)測(cè)與MTT或CCK8方法是目前兩種最常用的細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)方法。

原理：LDH以氧化型輔酶Ⅰ(NAD⁺)作為氫受體，使乳酸脫氫生成丙酮酸，丙酮酸與顯色劑（2, 4—二硝基苯肼）作用生成丙酮酸二硝基苯腙，其在堿性溶液中呈棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比，由此可推算出乳酸脫氫酶的活性。

適用范圍：用于定量測(cè)量血清、組織細(xì)胞培養(yǎng)基或組織細(xì)胞勻漿裂解液中的LDH活性，也常用于評(píng)估組織細(xì)胞損傷以及藥物毒性等。

組成： 試劑A：底物緩沖液，10 ml, 4℃ 避光保存1年；

            試劑B：11.3 mmol/L氧化型輔酶Ⅰ溶液，2 ml, –20℃ 保存，4℃可保存6周；

            試劑C：1mmol/L 2, 4—二硝基苯肼溶液，10 ml, 4℃ 避光保存半年以上；

            丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品母液 (5 μmol/ml)，0.5 ml, –20℃ 保存；

            終止試劑：0.6 mol/L NaOH , 30 ml, 常溫保存。

操作步驟：

一、樣本處理：

一）液體樣品處理：

血清用生理鹽水作1：10稀釋；腦脊液內(nèi)乳酸脫氫酶活力較低，直接以原液測(cè)定即可；其他體液也需1：10稀釋后測(cè)定。

二）細(xì)胞處理：

細(xì)胞用1% Triton X-100裂解，取10 μl細(xì)胞裂解液用于測(cè)定；細(xì)胞培養(yǎng)基可直接用于測(cè)定。

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

臨用前，將丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品母液用底物緩沖液稀釋成2.5、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125 μmol/ml 7個(gè)濃度，稀釋液4℃可保存一周。丙酮酸鈉0 μmol/ml的孔只加10 μl底物緩沖液，以此孔作為空白管調(diào)零，按照下述操作步驟進(jìn)行操作，而后在440nm波長(zhǎng)處讀取各吸光度，與其相應(yīng)的酶活力單位作圖，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

丙酮酸鈉濃度與乳酸脫氫酶活力單位的對(duì)應(yīng)關(guān)系

三、LDH酶活性測(cè)定：

1．取10 μl丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品或樣本加入到微孔板中。

2．將試劑A與試劑B以5:1的體積比混合，取60 μl混合液加到各孔，充分混勻，37℃水浴15分鐘。

3．加入2, 4—二硝基苯肼溶液50 μl，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣本充分混合，37℃水浴15分鐘。

4．加入150 μl 終止試劑，充分混合。

5．室溫放置3分鐘后，440nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

四、結(jié)果處理：440nm波長(zhǎng)處讀取樣本孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力單位。

體液：

作1：10稀釋后測(cè)定的體液實(shí)際酶活力單位即是測(cè)定的酶活力單位；

未經(jīng)稀釋的體液的實(shí)際酶活力單位=測(cè)定的酶活力單位/10；

細(xì)胞活力計(jì)算：

細(xì)胞活力用LDH釋放率來表示，后者值越大，表示細(xì)胞活力越差，受損程度越嚴(yán)重。

細(xì)胞LDH釋放率（%）=細(xì)胞培養(yǎng)基中測(cè)定的酶活力單位/（細(xì)胞裂解液測(cè)定的酶活力單位+細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)定的酶活力單位）×100%

乳酸脫氫酶活力單位定義：

每100m1血清中的LDH在37℃與底物作用15分鐘，能生成一微摩爾丙酮酸者即為一個(gè)乳酸脫氫酶活力單位。

以第四管為例，丙酮酸含量為0.005微摩爾，如稀釋后的血清測(cè)定結(jié)果相當(dāng)于第四管的光密度時(shí)，因稀釋前的血清用量為0.001ml，換算成100ml時(shí)就相當(dāng)于乳酸脫氫酶活力500 U／dl；

如果血清未經(jīng)稀釋，測(cè)定結(jié)果相當(dāng)于第四管光密度時(shí)，說明0.01ml血清在37℃與基質(zhì)作用15分鐘生成0.005微摩爾丙酮酸，換算成100ml血清就相當(dāng)于產(chǎn)生了50微摩爾丙酮酸，乳酸脫氫酶活力單位為50U/dl, 即測(cè)得的酶活力單位除以稀釋倍數(shù)10得實(shí)際的酶活力單位。

參考值：

  人血清LDH：190~310U/dl

注意事項(xiàng)：

1．紅細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活力較血清內(nèi)約高100倍。故標(biāo)本有輕微的溶血．測(cè)定的結(jié)果會(huì)比實(shí)際的結(jié)果高數(shù)倍。

2．草酸鹽可抑制乳酸脫氫酶活力，故不能用草酸鹽抗凝血漿測(cè)定。

3．測(cè)定結(jié)果超過2500U時(shí)，應(yīng)將樣本繼續(xù)稀釋后重新測(cè)定。  

4. 該方法以乳酸鹽和NAD⁺為底物，其優(yōu)點(diǎn)是乳酸鹽及NAD⁺底物液穩(wěn)定，冰箱保存時(shí)可穩(wěn)定半年以上，反應(yīng)的線性范圍較寬。

部分使用普利萊LDH活力定量試劑盒發(fā)表的SCI文章，供參考：

1、 Xie F, Jia L, Lin M, et al. ASPP2 attenuates triglycerides to protect against hepatocyte injury by reducing autophagy in a cell and mouse model of non‐alcoholic fatty liver disease[J]. Journal of cellular and molecular medicine, 2015, 19(1): 155-164.

2、 Wu Y, Huang M, Zhao P, et al. Vanadyl acetylacetonate upregulates PPARγ and adiponectin expression in differentiated rat adipocytes[J]. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2013, 18(6): 623-631.

3、 Liu X, Huang H, Liu G, et al. Multidentate zwitterionic chitosan oligosaccharide modified gold nanoparticles: stability, biocompatibility and cell interactions[J]. Nanoscale, 2013, 5(9): 3982-3991.

4、 Deng J, Liu S, Zou L, et al. Lipolysis response to endoplasmic reticulum stress in adipose cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(9): 6240-6249.

5、 Zu L, Jiang H, He J, et al. Salicylate blocks lipolytic actions of tumor necrosis factor-α in primary rat adipocytes[J]. Molecular pharmacology, 2008, 73(1): 215-223.