Caspase-6活性測定試劑盒C1116

描述：

Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導細胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP，剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A，其對于Lamin A的識別位點是VEID。測定原理：Caspase-6特異水解多肽底物VEID-pNA (Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，釋放的游離硝基苯胺pNA在405nm有最大吸光度。采用可見光光度比色法測定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測哺乳動物組織、細胞Caspase-6活性。

組成 (所示為100次檢測, 50次檢測試劑量減半)

1. 裂解緩沖液20ml, 4 oC

2. 反應緩沖液10ml, 4 oC

3. 底物 0.5ml,-20 oC避光

4. 10mM pNA標準品0.2ml, -20 oC避光

試劑常溫運輸，到達后按要求儲存，1年內(nèi)穩(wěn)定。

所需儀器：

可見光分光光度計配100μl比色杯，或酶標儀。最佳波長405nm，也可測OD400~450nm但靈敏度略降。

組織細胞準備：

Caspase活性測定值低，最常見原因是未發(fā)生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間點不恰當。誘導凋亡時，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高?？稍O(shè)置不同劑量和時間點如0、2、4、8、16、24小時，以檢測最佳的觀察點。通常2×10⁷細胞或2mg組織裂解于1ml可產(chǎn)生1~3mg/ml蛋白。初次測定時，單個測定反應可加~200μg蛋白物對應于2×10⁶細胞或2個孔的6孔板細胞。最少，單個測定反應需加20μg蛋白對應于2×10⁵個細胞或2個孔的12孔板細胞。勿用絲氨酸蛋白酶抑制劑如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。

1. (1)細胞裂解：1000g 5分鐘收集細胞，吸盡上清。每2~10×10⁶細胞加50~100μl裂解液震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。(2)組織裂解：3~10mg組織加100 μl裂解液放入小型玻璃勻漿器，上下勻漿30次。轉(zhuǎn)移勻漿液于離心管。

2. 4oC 12,000g 10分鐘，取上清測定，或-70oC保存。

3. 蛋白定量：用Bradford法測定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應使蛋白濃度達到1-3mg/ml，相當于每10μl待測樣品含10-30μg蛋白，否則應增加細胞用量。

測定pNA標準曲線：

1. 用反應緩沖液稀釋10mM pNA標準品為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設(shè)置不加pNA的零管。

2. 每一濃度取100μl加入96孔板或100μl比色杯，測定405nm吸光度OD值。

3. 每一濃度標準管OD405值為x軸，對應的pNA濃度為y軸，用Excel制作pNA濃度對OD405值的標準曲線。

樣品測定操作：

1. 按下表設(shè)置96孔板反應體系。底物最后加入以使各管反應起始時間相同。設(shè)置不加樣品的空白對照管。酶活力不足或過高，可增加或減少樣品。

2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37oC反應2小時，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2，此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜，但酶活性較強時，孵育時間過長將導致反應失去線性關(guān)系。

3. 樣品管OD405減去空白對照OD405，為樣品Caspase水解底物產(chǎn)生的pNA吸光度。根據(jù)標準曲線計算其含量，并以蛋白濃度校正之。

4. 測得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實驗處理組OD / 實驗對照組OD，簡單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein，精確但計算較復雜，參見說明。

反應體系參考表 (允許適當調(diào)整樣品加樣量)

說明：

1. Caspase酶活力單位定義：參考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 oC under saturated substrate concentrations。即當?shù)孜镲柡蜁r,一個Caspase酶活力單位定義為37 oC 1小時水解pNA底物，產(chǎn)生1nmol游離pNA。根據(jù)pNA標準曲線和樣品OD值，可計算出Caspase酶活力單位。

2. 除了處理組外，可設(shè)置陽性凋亡誘導劑組，陰性實驗對照可包括不具有凋亡誘導作用的試劑(如果能得到)處理組、溶劑對照組、或凋亡誘導零時間點。