活性氧ROS檢測試劑盒（紅色熒光）

貨號：ZK-PL3955

品牌：子科生物ZIKER

描述：

本試劑盒利用熒光探針DHE進行活性氧檢測。DHE可自由透過活細胞mo進入細胞內(nèi)，在細胞質(zhì)中呈藍色熒光，被細胞內(nèi)的ROS氧化后形成氧化乙啶摻入染色體DNA中，使細胞核呈現(xiàn)明亮的紅色熒光。在激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長610nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀、流式細胞儀等檢測熒光強度，測定細胞內(nèi)活性氧水平。具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便等優(yōu)點，是一種快速簡便的組織或培養(yǎng)活細胞中ROS經(jīng)典檢測方法。

適用范圍：

貼壁細胞、懸浮細胞、新鮮動物組織

工作波長：

激發(fā)波長480-535nm，最佳發(fā)射波長590-610nm

組成：

0.2ml, 5mM DHE，-20 oC避光保存 一年有效

所需設(shè)備：流式細胞儀、熒光酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計等

操作步驟：

一、 細胞樣本：

1. 收集細胞，進行活性氧測定

1.1 細胞收集：懸浮細胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用0.01M PBS或無血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；貼壁細胞：吸去培養(yǎng)液，用0.01M PBS或無血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細胞層全部進入PBS或培養(yǎng)液中，收集細胞懸液，用0.01M PBS或無血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；

1.2加入DHE探針：用稀釋好的DHE熒光探針重懸細胞沉淀，一般情況下，細胞密度要求1*106-2*107/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DHE工作濃度可在1μM~100 μM范圍內(nèi)，需進行預(yù)實驗確定最適濃度）。

1.3 37 oC孵育細胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?/span>5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

1.5 進行熒光檢測，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

2. 不收集細胞，直接將探針加入培養(yǎng)基測定

2.1加入DHE探針：去除細胞培養(yǎng)基上清，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋好的DHE探針（推薦探針終濃度為10 μM），加入探針的體積以能蓋住細胞為宜，通常6孔板單孔不少于500 μl。

2.2 37 oC孵育細胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?/span>5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

2.3 棄去上層培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或0.01M PBS反復(fù)吹打，使細胞層全部進入PBS或培養(yǎng)液中。

2.4收集細胞懸液，用0.01M PBS或無血清培養(yǎng)液洗滌2次，去除未進入細胞內(nèi)的探針，1000rpm，離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

2.5進行熒光檢測，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

二、 動物組織樣本

1.1細胞懸液制備：可采用單細胞懸液制備儀或傳統(tǒng)的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細胞懸液；

1.2加入DHE探針，加入DHE探針：去除細胞培養(yǎng)基上清，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋好的DHE探針（推薦探針終濃度為10μM）。

1.3 37 oC孵育細胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?/span>5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞

1.5 進行熒光檢測，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

注意事項：

（1）開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集于管底，避免開蓋時染液損失。

（2）要設(shè)有無DHE孵育的對照，即不加探針，只用0.01M PBS重懸的細胞。

（3）熒光探針標(biāo)記后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，以避免背景升高。多次清洗時注意操作規(guī)范，避免將細胞洗掉。

（4）對于藥物處理（孵育）時間較短的細胞（2小時以內(nèi)、也有建議4小時以內(nèi)），可以先用熒光染料進行標(biāo)記，后用藥物刺激細胞后。對于藥物處理時間較長的細胞（超過4小時或6小時以上），建議先用藥物處理（刺激）細胞，后用探針標(biāo)記。

（5）DHE在光照和空氣中易被氧化，保存和操作中應(yīng)注意避光。

（6）對不同的細胞和組織，應(yīng)選擇合適的孵育時間和濃度，以觀察ROS的變化。

（7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。