Calcein-AM/PI 活細胞/死細胞雙染試劑盒

貨號：ZK-PL4023

品牌：子科生物ZIKER

描述：鈣黃綠素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 可分別對活細胞和死細胞染色，用于同時對活細胞和死細胞進行熒光染色分析。Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm），在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞mo。進入細胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑如BCECF-AM和CFDA相比，Calcein, AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞mo，僅能穿過死細胞mo的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時 觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。 試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，單次可進行200μl細胞懸液染色。

規(guī)格：500次

組成及保存：

Calcein-AM Solution（2mM） 50μL   -20°C 避光干燥保存

PI Solution（2 mM） 150μL   -20°C 避光干燥保存

一年有效

操作步驟：

1. 工作液的配制

1）先將低溫保存的 Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 PI 溶液（2 mM）平衡至室溫。

注意：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。

2）取5μl Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 12.5μl PI 溶液（2 mM）至 5ml 1xPBS緩沖液（pH 7.4），充分混勻。 得到 Calcein-AM 的工作液濃度2μM，PI 的工作液濃度5μM。

由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM 和 PI 的最適濃度。梯度篩選的原則為 使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。

注意：由于 Calcein-AM 的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，且在當(dāng)天用完。

2. 染色步驟

2.1 貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。

懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。

2.2 去上清，用 1xPBS緩沖液（pH7.4）洗滌細胞2~3次，去除殘留的酯酶活性。

注意：由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會分解，導(dǎo)致空白上升，所以需要數(shù)次離心，用PBS洗滌數(shù)次直到完全洗凈。

2.3 制備細胞懸液，使其密度為 1×10 5~1×10 6細胞/ml。

2.4 取100μl染色工作液加入200μl細胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15min。

注意：如果需要，可延長孵育時間至 30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用 490±10 nm 激發(fā)濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進行檢測。

注意：可以使用以下方法優(yōu)化兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a) 在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細胞；

b) 用0.1-10μM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅對細胞核染色，而不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。

c) 用0.1-10μM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色。

注意事項：

1）由于 Calcein-AM 對濕度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM 工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）碘化丙啶（PI）操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清 洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。