AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

貨號：ZK-PL4030

品牌：子科生物ZIKER

描述：在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞mo脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞mo中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35～36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素FITC 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞mo，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞mo而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

適用：本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測

組成：20次

AnnexinV-FITC：100uL

Propidium Iodide：200uL

Binding Buffer（4X）：4mL

儲存條件：2-8℃  避光

操作方法：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

A：懸浮細(xì)胞：

1）收集細(xì)胞，1000-2000rpm 5min，小心去除上清。

2）PBS洗滌細(xì)胞兩次，具體方法：用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞，1000-2000rpm 5min，小心吸除上清。

B：貼壁細(xì)胞：

1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，用PBS洗滌，加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm 5min，小心吸除上清。

注意：加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

4）PBS洗滌細(xì)胞兩次，具體方法：用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，1000-2000rpm  5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）；

3. 用250uL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；

4. 取100uL的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5uL Annexin V-FITC，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25℃)避光孵育10-15min；

6. 上機(jī)前5min 加入10ul碘化丙啶PI溶液，輕輕混勻；

7. 在反應(yīng)管中加入400ul PBS重懸細(xì)胞，避光保存，隨即進(jìn)入流式細(xì)胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

流式細(xì)胞儀分析建議

1) 用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。

2) Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測；PI 紅色熒光（流式Ex=488nm,

Em≥630nm）通過FL2 或FL3 通道檢測，建議使用FL3。

3) 熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

注意事項：

1. 微量試劑取用前請離心集液。

2. Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要戴手套。

4. 本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，不推薦用于檢測組織樣本。

5. 推薦使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽性，而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止進(jìn)一步的損傷。

6. 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

7. 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，最終導(dǎo)致染色失敗。

8.因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測均需使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。