無(wú)菌藥品是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的特殊商品，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》2010修訂版(Good manufacturing practice，GMP)于2011年3月1日起正式頒布實(shí)施，對(duì)無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程控制提出了更為嚴(yán)格的要求，“應(yīng)當(dāng)限度的降低微生物、各種微粒和熱原的污染”，且“產(chǎn)品的無(wú)菌或其他質(zhì)量特性絕不能只依賴于任何形式的終處理或成品檢驗(yàn)(包括無(wú)菌檢查)”。因此，了解無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物負(fù)載情況，即微生物的種類(lèi)和分布情況，建立無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染溯源分析的有效方法具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
材料與方法
材料
培養(yǎng)基
硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)皿、胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)皿、TSA(加中和劑)接觸碟， 來(lái)源于成都生物制品研究所有限責(zé)任公司培養(yǎng)基室。
陽(yáng)性對(duì)照
試驗(yàn)菌株[CMCC(B)26003]金葡萄球菌。
儀器
默克MAS100 NT浮游菌檢測(cè)儀，Millipore Microfil微生物限度儀，無(wú)菌檢查電腦集菌儀，B×41光學(xué)成像顯微鏡，VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，生物安全柜。
主要試劑及耗材
滅菌0.1%蛋白胨溶液、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，自配；革蘭染色液，法國(guó)生物梅里埃公司；GN 鑒定卡、GP鑒定卡、BCL 鑒定卡、YST 鑒定卡，法國(guó)生物梅里埃公司。
方法
潔凈室環(huán)境及人員監(jiān)測(cè)
對(duì)乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)操作潔凈室進(jìn)行浮游菌、沉降菌和設(shè)施設(shè)備及人員表面微生物動(dòng)態(tài)檢測(cè)，C級(jí)(含局部層流) 每周一次，D級(jí)每月一次。表面微生物測(cè)試: 采用接觸碟法，即TSA(加中和劑)培養(yǎng)基充滿碟子并形成圓弧頂，取樣面積為 25 cm2，取樣時(shí)打開(kāi)碟蓋，無(wú)菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板10s左右，確保培養(yǎng)基表面與取樣點(diǎn)表面均勻充分接觸，再蓋上碟蓋。然后將采樣后平皿先倒置于20～25℃恒溫培養(yǎng)箱(室)中培養(yǎng)3d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，再倒置于30～35℃恒溫培養(yǎng)箱(室)中培養(yǎng)2～3d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并判定結(jié)果。
微生物限度
對(duì)乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)車(chē)間注射用水和純化水系統(tǒng)水點(diǎn)每周取樣一次，并使用 Millipore Microfil微生物限度儀進(jìn)行檢測(cè)。
無(wú)菌檢查
對(duì)2012年度生產(chǎn)的乙型腦炎減毒活疫苗所有批次中間產(chǎn)品使用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查。
菌型分析
采用菌落形態(tài)特征觀察、革蘭染色鏡檢以及使用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì) 2012 年度以上3項(xiàng)所獲的微生物進(jìn)行鑒定分析。
結(jié)果
潔凈室環(huán)境及人員
2012年1月至12月潔凈區(qū)環(huán)境微生物檢測(cè)包括浮游菌、沉降菌、設(shè)施設(shè)備及人員表面微生物檢測(cè)，

GMP無(wú)菌車(chē)間凈化裝修方案
3.5 送風(fēng)量、排風(fēng)量、回風(fēng)量、新風(fēng)量設(shè)計(jì)
送風(fēng)量應(yīng)滿足以下三個(gè)要求，并取三者大值。
（1）室內(nèi)潔凈度。
（2）室內(nèi)溫濕度。
（3）室內(nèi)供給的新風(fēng)量。
為簡(jiǎn)化計(jì)算，送風(fēng)量采用推薦值估算。根據(jù)《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》、《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》，如表 2 所示。
后，校核系統(tǒng)、房間的風(fēng)量：系統(tǒng)送風(fēng)量＝系統(tǒng)新風(fēng)量＋系統(tǒng)回風(fēng)量＝系統(tǒng)回風(fēng)量＋系統(tǒng)排風(fēng)量；房間送風(fēng)量＝房間回風(fēng)量＋房間排風(fēng)量。
3.6 負(fù)荷計(jì)算
根據(jù)《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》，潔凈室設(shè)計(jì)溫濕度如表 3。
表 3 潔凈室溫濕度
溫度（℃） 相對(duì)濕度（%）
22 ± 2 45 ~ 65
3.6.1 冷負(fù)荷
（1）采用不穩(wěn)態(tài)法逐一計(jì)算每一個(gè)系統(tǒng)每一時(shí)刻的冷負(fù)荷，確定綜合值。
（2）根據(jù)系統(tǒng)風(fēng)量計(jì)算每一個(gè)空調(diào)系統(tǒng)的制冷量。
（3）校核：系統(tǒng)風(fēng)量計(jì)算的制冷量應(yīng)大于或等于不穩(wěn)態(tài)法算的綜合值。
3.6.2 熱負(fù)荷
（1）采用穩(wěn)態(tài)法逐一計(jì)算每一個(gè)系統(tǒng)的熱負(fù)荷。
（2）根據(jù)系統(tǒng)風(fēng)量計(jì)算每一個(gè)空調(diào)系統(tǒng)的制熱量。
（3）校核：系統(tǒng)風(fēng)量計(jì)算的制熱量應(yīng)大于或等于穩(wěn)態(tài)法計(jì)算的熱負(fù)荷。
3.6.3 加濕量
根據(jù)系統(tǒng)風(fēng)量計(jì)算每一個(gè)空調(diào)系統(tǒng)的加濕量。
3.7 材料選擇
潔凈室空調(diào)系統(tǒng)的材料應(yīng)具有耐腐蝕、使用壽命長(zhǎng)、性能穩(wěn)定、不產(chǎn)塵屑的特點(diǎn)。故風(fēng)管采用熱鍍鋅鋼板制作，閥門(mén)采用碳鋼噴塑，風(fēng)口采用冷軋鋼板噴塑，空調(diào)箱外壁采用彩鋼板，內(nèi)壁采用不銹鋼。
4 節(jié)能設(shè)計(jì)
4.1 原車(chē)間因使用多年，存在房間氣密性差、保溫、隔熱性不佳、空調(diào)設(shè)備結(jié)露、A 區(qū)面積過(guò)大等問(wèn)題，造成能耗較大。改造后從以下幾方面考慮節(jié)能，見(jiàn)表 4、表 5。
5 消毒設(shè)計(jì)
消毒設(shè)計(jì)目前潔凈的消毒有臭氧消毒、甲醛消毒、過(guò)氧化氫消毒。臭氧消毒有消毒時(shí)間短、無(wú)殘留、無(wú)腐蝕的特點(diǎn)。甲醛消毒有殺菌普廣、穩(wěn)定、有腐蝕性的特點(diǎn)。過(guò)氧化氫消毒有消毒時(shí)間短、無(wú)殘留、環(huán)境影響小的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，采用甲醛消毒作為車(chē)間的消毒劑。消毒時(shí)，將甲醛置于不銹鋼容器內(nèi)，加入，將空氣溫度升至 30℃以上，循環(huán) 30 min，然后關(guān)閉空調(diào)機(jī)組，悶消 8h 后開(kāi)啟排風(fēng)機(jī)。具體做法是在總回風(fēng)管上設(shè)消毒旁通管路、電動(dòng)風(fēng)閥連接至排風(fēng)機(jī)。正常運(yùn)行時(shí)，消毒旁通管路上的電動(dòng)風(fēng)閥關(guān)閉。消毒時(shí)，關(guān)閉新風(fēng)電動(dòng)閥、排風(fēng)電動(dòng)閥、排風(fēng)機(jī)。消毒完畢后，開(kāi)啟消毒旁通管路上的電動(dòng)風(fēng)閥、排風(fēng)機(jī)、新風(fēng)閥，將甲醛排除干凈。
6 總結(jié)
隨著人們生活水平的提高，對(duì)藥品監(jiān)管以及藥品生產(chǎn)車(chē)間也提出了更高的要求。無(wú)菌藥品生產(chǎn)車(chē)間有潔凈度高、能耗高的特點(diǎn)。本次改造結(jié)合了無(wú)菌藥品的特點(diǎn)、車(chē)間環(huán)境、管理要求等多方面因素，即解決了改造前存在的問(wèn)題，又滿足了用戶使用要求，同時(shí)也符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）。

注：①環(huán)境及功能與普通區(qū)隔離。
②取決于排風(fēng)位置。
③取決于實(shí)驗(yàn)室使用的試劑種類(lèi)。
④如窗、閉路電視、雙向電話。
由表7可知，BSL-3和BSL-4實(shí)驗(yàn)室要求房間有負(fù)壓的氣流流向，通風(fēng)系統(tǒng)要有良好的氣流組織，排風(fēng)需經(jīng)高效過(guò)濾處理后排放。BSL-1實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有上述要求，而B(niǎo)SL-2實(shí)驗(yàn)室希望可以做到房間保持負(fù)壓和具有良好的氣流組織，但并非嚴(yán)格要求。
根據(jù)上述規(guī)定，對(duì)于生物制品生產(chǎn)中用的減毒株以及基因重組菌株等均屬于四類(lèi)病原微生物，所對(duì)應(yīng)的生物安全防護(hù)等級(jí)為BSL-1，按照這個(gè)要求減毒疫苗的生產(chǎn)就可以利用回風(fēng)。生物制品生產(chǎn)用的強(qiáng)毒株，如乙型腦炎病毒和檢驗(yàn)用攻擊毒株狂犬病街毒屬于二類(lèi)病原微生物，對(duì)應(yīng)生物安全防護(hù)等級(jí)為BSL-3，此類(lèi)產(chǎn)品不可利用回風(fēng)，排風(fēng)必須經(jīng)過(guò)濾。對(duì)于大部分三類(lèi)致病微生物，企業(yè)的慣例都是不利用回風(fēng)，排風(fēng)經(jīng)過(guò)過(guò)濾。
經(jīng)綜合考慮，本條規(guī)定了“三類(lèi)(含三類(lèi))危害程度以上的病原體操作區(qū)空氣不應(yīng)循環(huán)使用”。
1.2..5 凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)應(yīng)合理利用回風(fēng)。但在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，如固體物料的粉碎、稱(chēng)量、配料、混合、制粒、壓片、包衣、灌裝等生產(chǎn)工序或房間，常會(huì)散發(fā)各種粉塵、有害物質(zhì)等，為了防止通過(guò)空氣循環(huán)造成藥物的交叉污染，送入房間的空氣應(yīng)全部排出。在固體物料的生產(chǎn)中，因許多生產(chǎn)工序均有粉塵散發(fā)，所以凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)需要較大新風(fēng)比，甚至高達(dá)60％～70％，能耗很大。若能對(duì)空調(diào)回風(fēng)中的粉塵等物質(zhì)進(jìn)行充分和有效地處理，使之不再造成交叉污染，利用回風(fēng)也就成為可能。圖3為某固體制劑車(chē)間對(duì)回風(fēng)中粉塵處理后利用的示例，由于減少了凈化空調(diào)的新風(fēng)比，明顯降低了經(jīng)常運(yùn)行費(fèi)用和初步投資費(fèi)用。
圖3 空氣流程示意圖(帶回風(fēng)處理)
如圖3所示回風(fēng)經(jīng)處理后利用的方案中，由于回風(fēng)系統(tǒng)增加了中效和高效空氣過(guò)濾器，運(yùn)行中雖節(jié)省了冷、熱負(fù)荷，但增加了更換過(guò)濾器的費(fèi)用，也增加了系統(tǒng)的阻力，是否經(jīng)濟(jì)合理，應(yīng)做技術(shù)經(jīng)濟(jì)比較而定。如工藝設(shè)備狀況差，操作中粉塵散發(fā)大，則空氣過(guò)濾器壽命很短，所增加的費(fèi)用可能會(huì)超過(guò)直排風(fēng)的運(yùn)行費(fèi)，所以要對(duì)工藝及設(shè)備的操作和運(yùn)行情況進(jìn)行綜合考慮，以確定采用回風(fēng)利用方案是否經(jīng)濟(jì)合理。
1.2.6 若將除塵器直接設(shè)在生產(chǎn)房間內(nèi)，可能出現(xiàn)的問(wèn)題是：噪聲大，對(duì)操作人員造成影響。進(jìn)入除塵器的空氣在室內(nèi)循環(huán)時(shí)，若濾袋有泄漏，上一批物料可能隨空氣回至室內(nèi)而造成混藥。除塵器清灰時(shí)易污染房間地面及周?chē)h(huán)境。
所以單機(jī)除塵器應(yīng)設(shè)置在靠近需除塵房間的單獨(dú)小機(jī)房?jī)?nèi)，并將除塵器排風(fēng)接出，由于除塵器的啟閉將影響房間的風(fēng)量、壓力平衡。因此，在工程設(shè)計(jì)上還要考慮當(dāng)除塵器間歇工作時(shí)，為維持生產(chǎn)房間壓差應(yīng)采取的措施。
當(dāng)采用集中式除塵系統(tǒng)時(shí)，機(jī)房應(yīng)靠近需除塵房間的，以盡可能地縮短管線。
在設(shè)計(jì)帶多個(gè)吸塵口和多根分支管的除塵系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)避免在水平除塵干管上垂直向下連接支管的做法。主要是為防止在系統(tǒng)啟停時(shí)，水平干管內(nèi)粉塵墜落至設(shè)備或潔凈室而引起交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。排塵罩的設(shè)置應(yīng)緊靠塵源，或與設(shè)備排塵風(fēng)口直接連接，不應(yīng)遠(yuǎn)離發(fā)塵源。
當(dāng)機(jī)房門(mén)開(kāi)向醫(yī)藥潔凈室時(shí)，由于除塵器操作人員的進(jìn)出要通過(guò)醫(yī)藥潔凈室，應(yīng)向機(jī)房送入凈化空氣，滿足機(jī)房空氣潔凈級(jí)別的要求，溫度、濕度無(wú)嚴(yán)格要求。
1.2..7 本條為強(qiáng)制性條文。對(duì)除塵系統(tǒng)的防火防爆要求是根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《建筑設(shè)計(jì)防火規(guī)范》GB 50016和《爆炸危險(xiǎn)環(huán)境電力裝置設(shè)計(jì)規(guī)范》GB 50058的有關(guān)規(guī)定，并結(jié)合藥品生產(chǎn)的具體情況而制定。
1.2.8 本條為強(qiáng)制性條文。與生產(chǎn)安全和環(huán)境衛(wèi)生有關(guān)的醫(yī)藥潔凈室排風(fēng)系統(tǒng)，應(yīng)按照現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
1 甲類(lèi)、乙類(lèi)生產(chǎn)區(qū)域的排風(fēng)系統(tǒng)，其輸送的介質(zhì)具有危險(xiǎn)性，與危險(xiǎn)氣體接觸的閥門(mén)、風(fēng)管及設(shè)備應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的防爆、防靜電接地等放火防爆措施，具體做法可參照現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《工業(yè)建筑供暖通風(fēng)與空氣調(diào)節(jié)設(shè)計(jì)規(guī)范》GB 50019-2015，第6．9節(jié)“放火與防爆”中的相應(yīng)條款。
2 排放進(jìn)入大氣的含塵或有害等污染氣體應(yīng)符合國(guó)家或地方現(xiàn)行排放標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不滿足時(shí)，應(yīng)采取相應(yīng)的綜合處理措施使排放達(dá)到現(xiàn)行國(guó)家或地方“大氣污染物綜合排放標(biāo)準(zhǔn)”的要求，排放濃度及排放總量是我國(guó)污染排放控制的兩項(xiàng)指標(biāo)，均不能違反。

為便于對(duì)各凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)、各醫(yī)藥潔凈室進(jìn)行風(fēng)量平衡和壓差調(diào)整，不同系統(tǒng)的排風(fēng)應(yīng)分開(kāi)設(shè)置。
由于散發(fā)粉塵和有害氣體區(qū)域的排風(fēng)與一般排風(fēng)的處置方式不同，同時(shí)又為了避免產(chǎn)生粉塵和有害氣體區(qū)域與一般區(qū)域相串通，故兩者的排風(fēng)系統(tǒng)應(yīng)分開(kāi)設(shè)置。
1.2.12 本條為強(qiáng)制性條文。本條款規(guī)定是參照現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《工業(yè)建筑供暖通風(fēng)與空氣調(diào)節(jié)設(shè)計(jì)規(guī)范》GB 50019制定的。
1.2.13 我國(guó)藥品GMP(2010年修訂)對(duì)于人員凈化用室的潔凈要求有了新的規(guī)定，本規(guī)范條了相應(yīng)的修改：
1 為保證人員凈化用室氣流由高潔凈級(jí)別流向低潔凈級(jí)別，當(dāng)門(mén)處于正常關(guān)閉位置時(shí)，毗鄰更衣室之間需保持一定的壓力梯度。各更衣室之間大體可按以下原則確定其壓力梯度：靠近潔凈區(qū)氣鎖門(mén)兩側(cè)為5Pa；不同級(jí)別更衣室之間為10Pa；相同級(jí)別更衣室之間為5Pa；換鞋區(qū)與外走道之間為0Pa～5Pa。
上述靠近潔凈區(qū)氣鎖門(mén)兩側(cè)壓差為5Pa，是由于考慮到氣鎖潔凈級(jí)別與毗鄰的潔凈室靜態(tài)級(jí)別相同，當(dāng)氣鎖只有一扇門(mén)被打開(kāi)時(shí)，不同級(jí)別更衣室之間仍可保持大于或等于10Pa的壓差。
2 規(guī)定了人員凈化用室后段、前段各房間潔凈級(jí)別的原則。
對(duì)于非無(wú)菌潔凈室，人員凈化用室前段為換鞋、更外衣，后段為更潔凈服；對(duì)于無(wú)菌潔凈室，前段為換鞋、更換外衣、更換無(wú)菌內(nèi)衣，后段為更換無(wú)菌外衣。
上述換鞋、更換外衣可設(shè)在有潔凈送風(fēng)的清潔區(qū)。
3 由于更衣室體積較小、更衣時(shí)動(dòng)作幅度偏大、發(fā)塵量較大，所以更衣室的送風(fēng)需要維持其級(jí)別足夠的送風(fēng)量，使其盡快自凈。
4 本條針對(duì)特殊藥品人員凈化用室通道中正壓或負(fù)壓氣鎖，其氣鎖的設(shè)置應(yīng)滿足下列要求：為阻斷生產(chǎn)區(qū)空氣外泄，在更衣進(jìn)入通道中，穿潔凈外衣(無(wú)菌外衣)與潔凈生產(chǎn)區(qū)之間設(shè)正壓氣鎖、氣鎖壓力高于兩側(cè)房間；在退出通道中，設(shè)脫潔凈外衣為負(fù)壓氣鎖，空氣壓力低于兩側(cè)房間(兩側(cè)房間的潔凈級(jí)別不得低于負(fù)壓氣鎖)，以此阻斷潔凈生產(chǎn)區(qū)空氣通過(guò)人員凈化通道擴(kuò)散。
有關(guān)人員凈化更衣室的布置、潔凈級(jí)別劃分、房間壓力和氣流流向、壓差計(jì)設(shè)置，可以參照《藥品GMP指南——廠房設(shè)施與設(shè)備》“空調(diào)凈化系統(tǒng)”中的5．2．10凈化更衣。
生產(chǎn)廠房的人員總更衣區(qū)不屬潔凈區(qū)，其中的換鞋、存外衣、盥洗、廁所、淋浴等房間會(huì)產(chǎn)生灰塵、臭氣和水汽，所以應(yīng)設(shè)置通風(fēng)措施。具體的做法可送入經(jīng)過(guò)濾后的室外空氣，廁所、浴室單獨(dú)設(shè)置排風(fēng)并使保持負(fù)壓。
1.2.15 根據(jù)我國(guó)藥品GMP(2010年修訂)附錄1“無(wú)菌藥品”中第三十八條的規(guī)定，醫(yī)藥潔凈室空氣凈化系統(tǒng)應(yīng)保持連續(xù)運(yùn)行，維持相應(yīng)的潔凈級(jí)別和對(duì)周?chē)图?jí)別區(qū)域的正壓，維持良好的氣流方向。因故停機(jī)再次開(kāi)啟空氣凈化系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行必要的驗(yàn)證以確認(rèn)其仍能達(dá)到規(guī)定的潔凈級(jí)別。
在非生產(chǎn)時(shí)間，由于潔凈室內(nèi)主要污染源(操作人員)的撤離，室內(nèi)的發(fā)塵量大大降低，為了節(jié)省運(yùn)行費(fèi)用，在滿足潔凈級(jí)別和正壓的前提條件下，可以采用降低空氣凈化系統(tǒng)風(fēng)量的方法。而降低多少風(fēng)量，需由各生產(chǎn)廠根據(jù)運(yùn)行實(shí)踐中的不同情況予以確定。
圖4為某廠灌封間(B級(jí)潔凈區(qū))從動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o態(tài)恢復(fù)時(shí)間內(nèi)室內(nèi)微粒數(shù)的變化曲線圖(室內(nèi)換氣次數(shù)為55次/h、操作人員6人)。當(dāng)潔凈室由動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o態(tài)時(shí)，室內(nèi)微粒數(shù)迅速降低，若仍維持動(dòng)態(tài)條件下的55次/h換氣次數(shù)，室內(nèi)實(shí)測(cè)對(duì)于大于或等于0．5μm、大于或等于5．0μm的微粒的靜態(tài)限值仍有較大空間(如對(duì)大于或等于0．5μm，靜態(tài)實(shí)測(cè)為27顆／ft3，而B(niǎo)級(jí)的靜態(tài)限值相當(dāng)于100顆／ft3)，可以認(rèn)為在非生產(chǎn)狀態(tài)下減少送風(fēng)量是完全可行的。