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惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。


在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。


根據(jù)不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。